红景天苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化能力的体外实验

背景:骨缺损可直接影响牙齿种植的成功率及种植体的长期稳定性。研究显示红景天苷可促进成骨细胞增殖、分化,但对于其成骨分化相关通路具体研究不多。目的:体外细胞实验研究红景天苷对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响,并探究其对相关基因和蛋白表达的影响。方法:采用CCK-8实验和碱性磷酸酶实验筛选红景天苷(0.5,1,5,10,50μmol/L)促进MC3T3-E1细胞增殖和分化的最佳浓度。实验分为4组:对照组、红景天苷组、红景天苷+LY294002组、LY294002组,分别用成骨诱导液、含10μmol/L红景天苷、10μmol/L红景天苷+10μmol/L LY294002、10μmol/L LY294002的成骨诱导液进行培养,观察红景天苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对成骨相关基因和蛋白表达的影响。结果与结论:①CCK-8实验和碱性磷酸酶实验显示:红景天苷促进MC3T3-E1细胞增殖的作用在10μmol/L时最显著;②与对照组相比,红景天苷可以促进矿化、促进细胞黏附、减少细胞死亡,提高Runx-2、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达(P<0.01),提高Runx-2和p-Akt蛋白表达(P<0.01);而添加PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002则可逆转以上结果;③结果表明,红景天苷能促进MC3T3-E1细胞矿化,并能促进成骨相关基因、蛋白的表达,这可能与PI3K/Akt信号通路的激活有关。

黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨

背景:氧化应激是导致骨质疏松症的主要原因之一,减少氧化应激水平与增加抗氧化防御是治疗骨质疏松症的重要研究方向。研究证实黄芪甲苷具有抗骨质疏松作用,但其作用机制尚不明确。目的:探讨黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞成骨的作用。方法:将MC3T3-E1细胞分4组培养:对照组加入完全培养基,模型组加入含过氧化氢的完全培养基干预24 h后更换为完全培养基,黄芪甲苷组加入含过氧化氢、黄芪甲苷的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷的完全培养基,抑制剂组加入含过氧化氢、黄芪甲苷、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)抑制剂的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷、ERK抑制剂的完全培养基。过氧化氢干预48 h后,通过丙二醛含量检测黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞氧化应激的缓解作用;过氧化氢干预48 h后进行成骨诱导培养,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色验证MC3T3-E1细胞成骨及矿化能力,通过RT-qPCR检测成骨相关基因的表达,Western blot检测成骨相关蛋白及ERK/腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路蛋白的表达。结果与结论:(1)模型组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均少于对照组(P<0.05),黄芪甲苷组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均多于模型组(P<0.05)。(2)与对照组比较,模型组细胞内丙二醛含量增加(P<0.05),骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均降低(P<0.05),AMPK mRNA与p-AMPK蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,黄芪甲苷组细胞内丙二醛含量减少(P<0.05),骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均升高(P<0.05),ERK1/2、AMPK mRNA表达升高(P<0.05),p-AMPK、p-ERK1/2蛋白表达均升高(P<0.05);ERK抑制剂可部分抑制黄芪甲苷的上述作用。(3)结果表明,黄芪甲苷可通过激活ERK/AMPK信号通路促进氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的成骨分化。

初级纤毛介导成骨前体细胞系MC3T3-E1传代衰老减低成骨分化能力

背景:在大段骨缺损修复中,由于种子细胞传代等多种因素可引起成骨类细胞衰老,造成组织工程骨植入体内后成骨分化活性降低。近年来,初级纤毛介导细胞衰老的机制已被广泛研究,但“传代衰老-成骨活性减低”的初级纤毛相关机制尚未完全明了。目的:探讨初级纤毛调控成骨性MC3T3-E1细胞传代衰老的可能机制。方法:成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞传代至第10代(早期传代)及第40代(晚期传代),同时使用siRNA沉默IFT88阻碍初级纤毛生成,即将细胞分为第10代组、第40代组、第10代+siRNA IFT88-组、第40代+siRNA IFT88-组。各组细胞成骨诱导3 d,采用RT-PCR和Western blot检测衰老标志物CDKN2A(P16)的表达、成骨活性标志物骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶的表达、Hedgehog通路IHH的表达;茜素红染色和初级纤毛免疫荧光染色分析初级纤毛形态;对初级纤毛阳性率与IHH、骨形态发生蛋白2的表达进行Spearman相关性分析。结果与结论:①成骨诱导3 d,第40代组MC3T3-E1细胞的CDKN2A(P16)表达显著高于第10代组,而在siRNA IFT88-干预后差异消失;②第10代组的初级纤毛细胞阳性率高于第40代组,siRNA IFT88-则显著性抑制第10代与第40代细胞的初级纤毛表达;③第10代组MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶及骨形态发生蛋白2的转录活性和蛋白表达均高于第40代组,通过siRNA抑制初级纤毛表达后,上述差异减低或者消失;④初级纤毛细胞阳性率与IHH蛋白表达及骨形态发生蛋白2蛋白表达呈正相关。结果表明:初级纤毛介导了成骨性MC3T3-E1细胞的传代衰老,可调控成骨分化能力。

人胸腺素α_1基因工程菌的构建与表达

胸腺素α1(Thymosinalpha1,Tα1)是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂,临床用途广泛.为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成编码Tα1的基因,克隆于pUCmT,转化E.coliJF1125,经测序证明序列正确后,克隆入pET39(b)的BspT 和BamH 位点,成功地构建出包含信号肽,DsbA,连接肽,6个His,EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),胸腺素α1的表达载体,转化E.coliBL21(DE3),获得胸腺素α1基因工程菌.SDS-PAGE分析表明,经0.1mmol/LIPTG和30℃诱导8h,在大肠杆菌周质中大量表达表观分子量31kD左右的融合蛋白.为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组胸腺素α1创造条件.

胸腺素α_1对鸡生长性能及免疫器官发育的影响

通过对照试验在 4日龄和 7日龄时 ,低剂量组、中剂量组和高剂量组每只鸡分别肌注 0 .0 1 5 mg·kg- 1 ,0 .0 3 mg· kg- 1 和 0 .0 6mg· kg- 1 体重剂量的胸腺素α1 ( Tα1 ) ,对照组注射等量的生理盐水。试验期为 5 6d,观察 Tα1 对鸡体重、饲料转化率、法氏囊指数、胸腺指数、和脾脏指数的影响。结果表明 :在 3 5 ,42和 5 6日龄时 ,低剂量组鸡的体重显著高于其他各组 ( P<0 .0 5 ) ,而在 1 4和 2 1日龄时各组平均体重差异不显著 ( P>0 .0 5 )。在整个试验期间 ,低剂量组的饲料报酬均高于其他三组 ;低剂量组的法氏囊指数均高于其他三组 ,并在 1 4日龄时与对照组和中剂量组差异显著 ( P <0 .0 5 ) ,而在 3 5日龄与对照组和高剂量组差异显著 ( P <0 .0 5 ) ;低剂量组的胸腺指数也高于其他三组 ,1 4日龄时与对照组差异显著 ( P <0 .0 5 ) ,而与中剂量组和高剂量组差异不显著( P>0 .0 5 ) ,但在 3 5和 5 6日龄时差异显著 ( P <0 .0 5 ) ;低剂量组的脾脏指数高于其他三组 ,且在 3 5和 5 6日龄差异显著 ( P <0 .0 5 )。

重组人胸腺素α_1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化(英文)

为提高人胸腺素α1(Tα1)融合蛋白在大肠杆菌中的表达量,研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21(DE3)宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8 000分析结果表明,重组菌以LB为培养基,卡那霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.5,所加IPTG的浓度为0.5 mmol/L,27.5℃摇床200 r/min振荡诱导培养10 h时,可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白,占周质蛋白总量的64.7%,为下一步纯化工作提供了方便。

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .

胸腺素α_1基因在钝顶螺旋藻中的表达

将钝顶螺旋藻 (Spirulinaplatensis)在 2 4℃培养 ,并经 2mmol/LEDTA预处理16～ 2 4h ,以本实验室构建的基因整合平台系统供体质粒 pEUTISI进行超声波转化螺旋藻 ,经筛选获得了具G4 18抗性的转化藻株。通过PCR扩增和Southern杂交证实 ,pEUTISI中目的基因UB Tα1和nptII基因已整合到钝顶螺旋藻染色体上。转化藻株经4 5℃热诱导 4 0min后 ,进行蛋白质SDS PAGE电泳和Westernblot,杂交结果证实 ,外源胸腺素α1基因在螺旋藻中得到有效表达。

胸腺素α_1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1(thymosinalpha 1,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因 ,克隆于 pUC19的EcoRI和PstI位点 ,经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入 pThioHisA的EcoRI和PstI位点 ,转化大肠杆菌TOP10菌种 ,酶切鉴定证明正确后 ,经 1mmol/LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,并经Westernblot分析证实。用离子交换柱层析可纯化出硫氧还蛋白与Tα1④的融合蛋白 ,利用3H -TdR掺入法证实 ,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。

重组胸腺素α_1的分离纯化和活性测定

目的 利用融合表达载体 p Thio His A的重组质粒p Thio His A- Tα1 4,转化大肠杆菌 TOP10得到的工程菌 ,来分离纯化表达的胸腺素 α1 (thym osin alpha1,Tα1 ) .方法 将高效表达融合蛋白的工程菌用细胞破碎器裂解 ,经 80℃热处理 ,离心上清采用 Q- Sepharose FF阴离子交换色谱纯化融合蛋白 .融合蛋白经 CNBr裂解后用常压离子交换色谱纯化Tα1 单体 .应用 SDS- PAGE,2 L - Tricine- SDS- PAGE和 HPL C进行鉴定 .结果 SDS- PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白占菌体总蛋白的 40 0 g· kg- 1 .经 2 L - Tricine- SDS- PAGE分析证实 ,融合蛋白可裂解出 Tα1 单体 ,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出 Tα1 单体 ,HPL C鉴定纯化出的 Tα1 纯度可达95 0 g· kg- 1以上 .利用 3H- Td R进行的生物活性测定表明 ,在致有丝分裂原 Con A存在的条件下 ,融合蛋白和 Tα1 单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 ,与化学合成的Tα1 相比具有相似的生物活性 .结论 该方法是分离纯化Tα1 简便易行 ,经济有效的方法 ;同时也为 Tα1

合成胸腺素α_1的生物活性研究

利用固相多肽合成中的 Boc和 Fmoc途径分别合成了胸腺素α1 (S- Tα1 )。后者的合成产率 (去保护基后粗肽量 /理论量 )为 80 % ,大于前者的 64.2 %。在 Fmoc方法合成中 ,用 Fmoc- Asn(Trt)上羟基树脂 (HMP树脂 )提高了合成产率。经 FPLC纯化后 ,Tα1 用 HPLC、毛细管电泳、等电聚焦电泳鉴定纯度均一 ;质谱和 N端序列分析证明其符合理论值。Tα1 活性测定 ,表明 S- Tα1 能提高淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应 ,增强 NK细胞杀伤活性 ,具有增加淋巴细胞产生 IFN- γ的作用 ,我们的合成产物与国外对照品 Z- Tα1 呈现相仿的活性。此工作为进一步研究 Tα1

重组胸腺素α_1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1 (thymosinalpha1,Tα1 )的串联体并进行纯化、鉴定 .方法 将 Tα1 的基因拆分为 4个片段进行合成 ,退火后经 PCR获得串联体基因 ,测序正确后克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxin)融合蛋白表达载体 p Thio His A中 ,转化大肠杆菌 TOP10菌株 ,IPTG诱导表达 ,表达的融合蛋白经过 80℃热处理及阴离子交换柱Q- Sepharose Fast Flow进行纯化 ,Western- blot进行鉴定 .结果 获得了纯化的 Thioredoxin- Tα1 3,分子质量约为 31ku.结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法 ,Tα1

胸腺素α_1对墟岗黄鸡免疫器官组织学结构的影响

本试验研究了不同剂量的胸腺素α1(Tα1)对墟岗黄母鸡免疫器官指数和组织学结构的影响。结果表明:0.015mg/kg体重剂量的Tα1可显著提高鸡免疫器官指数,可使胸腺皮质增宽,髓质胸腺小体数和胸腺细胞数增加;脾脏胸腺依赖区和法氏囊依赖区细胞增殖;高剂量Tα1则引起法氏囊髓质局部细胞变性和坏死。

天然胸腺素α_1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的为降低CNBr裂解融合蛋白的毒副作用 ,改进利用基因重组技术制备胸腺素α1 (Tα1 )的流程工艺。方法按大肠杆菌惯用密码合成Tα1 基因 ,克隆于质粒pGEM 3Zf的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,裂解位点为羟胺裂解位点Asn Gly对应的核苷酸序列 ,测序正确后用BamHⅠ和BglⅡ位点串联为Tα1 4串体 (Tα1 ④ )和Tα1 8串体 (Tα1 ⑧ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌TOP1 0。结果经 1mmol LIPTG诱导4h获得了硫氧还蛋白 (thioredoxin)与Tα1 ④和Tα1 ⑧的融合表达 ,用离子交换色谱可纯化出融合蛋白 ,羟胺裂解融合蛋白 ,能够释放出Tα1 单体。结论羟胺能够裂解融合蛋白释放出天然Tα1 。

蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942穿梭表达质粒的构建及胸腺素α_1基因的表达

利用本实验室构建的含蓝藻Plectonema boryanum内源小质粒的穿梭质粒pPRS-1,改建成含热诱导启动子、泛素融合的胸腺素α_1(UB-Tα_1)目的基因、卡那霉素抗性选择标记、rbcs终止子的新的穿梭表达重组质粒pPRFUT。将这种重组质粒转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株。经Southern-blot杂交证实,穿梭表达质粒已转入蓝藻Synechococcus sp. PCC7942细胞中;在42℃热诱导30min后,目的基因UB-Tα_1得到较高水平表达,表达量约占总蛋白量的7.5%。

聚(苯乙烯-二乙烯基苯)反相高效液相色谱填料在胸腺素α_1分离中的应用

采用高聚物型苯乙烯-二乙烯基苯（PS—DVB）麦科菲反相高效液相色谱柱（MKF—RP—MH）分离胸腺素α1，优化色谱条件为：流动相A：0．01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7．0或8．0），流动相B：乙腈，梯度洗脱条件0～20min，0％～10％乙腈，20～40min，10％～30％乙腈；温度：30℃；流速：0．8mL／min；检测波长：214nm。在优化条件下分离了胸腺素α1标准品和样品。样品浓度在0．05～4g/L时，线性方程为C=0．0099A-0．0798（r=0．9994），胸腺素α1最大载样量为120μg（6g／L）。

重组胸腺素α_1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达重组胸腺素α1(Tα1) ,并进行纯化、鉴定。方法 使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Ref蛋白 (T7噬菌体蛋白 )和Tα1的融合基因 ,并克隆在表达载体 pBV2 2 0中 ,转化E .coliDH5α ,温度诱导表达 ,表达的重组蛋白Ref Tα1经CM SepharoseFF阳离子柱进行纯化 ,Western blot进行鉴定。结果 获得了纯化的重组蛋白Ref Tα1,相对分子质量约为 15 0 0 0。结论 用融合基因的方法表达小分子多肽是一种可行的方法 ,Ref Tα1的成功表达为进一步研究其生物学活性奠定了基础。

老年反复呼吸道感染患者T淋巴细胞亚群变化及胸腺肽α_1干预研究

目的观察老年反复呼吸道感染患者T淋巴细胞亚群变化及胸腺肽干预对其免疫功能的影响。方法将46例老年反复呼吸道感染患者分为治疗组和对照组,各23例,治疗组在常规治疗下,加用胸腺肽α11.6 mg皮下注射,每周2次,6个月为1个疗程。对照组给予常规治疗。比较两组间呼吸道感染发生情况及T淋巴细胞亚群变化。结果治疗后,治疗组CD3、CD4及CD4/CD8升高,CD8下降。与对照组比较,治疗组发生呼吸道感染次数减少,程度降低(P<0.01)。结论胸腺肽α1预防和治疗老年反复呼吸道感染具有良好的临床疗效,可改善T淋巴细胞亚群免疫功能。

胸腺素α_1对离体培养的鸡脾脏淋巴细胞分泌功能及基因表达的影响

采用MTT比色法、RIA法和相对半定量RT PCR法分别研究了不同浓度的人工合成胸腺素α1(Tα1)对离体培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖转化、白细胞介素2(IL 2)和白细胞介素6(IL 6)分泌及基因表达的影响.结果表明,采用1和10μg·mL-1的Tα1处理细胞36h,能显著增加由ConA诱导24h的脾脏淋巴细胞的增殖转化率,显著提高细胞培养上清液中IL 2的含量(P<0 05),而对IL 6的分泌无显著影响(P>0 05);同时发现,在10μg·mL-1Tα1处理淋巴细胞36h后用ConA诱导12h,对淋巴细胞IL 2和IL 6基因的表达无显著影响(P>0 05).提示Tα1可通过促进IL 2的分泌,进而促进脾脏淋巴细胞增殖转化,而且其可能主要在基因转录后翻译水平上对IL 2分泌发挥影响.

应用液相色谱法分离纯化固相化学合成胸腺素α_1

By using ion-exchange preparative chromatography (IEPC) and reversed-phase high performance liquid preparative chromatography(RP-HPLPC), thymosin α 1 was isolated and purified from the crude product synthesized by the solid-phase peptide synthesis(SPPS) method. The purity of the final product reached 95% through ion-exchange chromatography on DEAE Sepharose Fast Flow chromatography and Delta-Pak TM C18 purification after optimizing the chromatographic conditions. The capacity of purification process was 50mg/circle. The total yield was 36%. The technology is simple and reliable, and can be scaled up easily.