胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白在蕈样肉芽肿患者中的表达情况及临床意义

目的探讨胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)在蕈样肉芽肿(MF)患者中的表达情况及临床意义。方法选择62例MF患者作为观察组,其中斑片期25例,斑块期24例,肿瘤期13例,同时选取30例良性炎症性皮肤病患者作为对照组。采用免疫组织化学染色法检测两组患者中TOX蛋白的表达情况,比较观察组和对照组患者中TOX蛋白的阳性表达率,比较斑片期、斑块期、肿瘤期MF患者中TOX蛋白的阳性表达率。结果观察组患者中TOX蛋白的阳性表达率为91.94%(57/62),明显高于对照组的30.00%(9/30),差异有统计学意义(P﹤0.01)。斑片期、斑块期、肿瘤期MF患者中TOX蛋白的阳性表达率分别为80.00%(20/25)、100%(24/24)、100%(13/13),差异有统计学意义(P﹤0.05);但两两比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论TOX蛋白在MF患者中的表达水平较高,可能在疾病进展中具有一定作用,值得进一步研究。

尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征

为了解析与胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白4(tox high mobility group box family member 4,TOX4)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)响应无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染过程中的功能,利用聚合酶链式反应(PCR)克隆和鉴定尼罗罗非鱼TOX4基因(GenBank登录号:XP003458812)的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,对推导的TOX4氨基酸序列进行生物信息学分析,分析其亚细胞定位特征,以及在尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞亚群的分布特征,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析TOX4基因在健康鱼各组织及响应无乳链球菌感染过程中的表达模式。结果表明:尼罗罗非鱼TOX4基因的ORF全长为2004 bp,编码667个氨基酸,预测TOX4蛋白的相对分子质量为69060,理论等电点为4.69,无信号肽序列及跨膜结构,具有一个HMG保守结构域;亚细胞定位结果显示,TOX4蛋白主要表达于细胞核中;多序列比对及系统进化分析均显示,尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)TOX4氨基酸序列的同源性最高;qRT-PCR分析显示,TOX4基因在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,且在血液中表达量最高;单细胞转录组数据分析显示,TOX4基因主要在尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(nonspecific cytotoxic cell,NCC)和巨噬细胞(macrophage,Mφ)中表达;经无乳链球菌感染后,尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏中TOX4基因的表达量显著上调,并在感染后12 h(脑、头肾、肠道)和48 h(脾脏)达到峰值。研究表明,TOX4可能参与尼罗罗非鱼响应细菌感染的免疫应答过程。

多参数TOX免疫表型法的建立及在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤中的应用

目的:建立多参数流式检测胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞中的免疫表型法,以及其在1例罕见CD4-CD56^(+)表型的血液恶性肿瘤母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)患者中的应用分析。方法:收集1例BPDCN患者骨髓(BM)和外周血(PB),2例非肿瘤手术患者和1例健康者BM以及11例健康者(HI)PB分别作为BM和PB对照组,利用多色流式单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TOX、PD-1、Tim-3、CD244及相应同型对照进行流式细胞检测。结果:流式检测结果提示,BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)CD3^(+)、TOX^(+)CD4^(+)和TOX^(+)CD8^(+)T细胞比例均比对照组升高;BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)PD-1^(+)CD8^(+)、TOX^(+)Tim-3^(+)CD8^(+)和TOX^(+)CD244^(+)CD8^(+)耗竭性T细胞中的分布比例也显著高于对照组。此外,在BPDCN患者BM和PB的CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg细胞中TOX^(+)细胞分布比例高于对照组;同时TOX^(+)细胞在PD-1^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg、Tim-3^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg和CD244^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg耗竭性T细胞中的分布比例也明显高于对照组。结论:成功建立多参数流式细胞术检测PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞亚群中TOX免疫表型法,TOX可能是BPDCN患者T细胞免疫调节的重要转录因子。

再生障碍性贫血患者外周血CD8^(+)T细胞TOX与抑制性受体的表达水平及相关性分析

目的探讨再生障碍性贫血(AA)患者外周血CD8^(+)T细胞中胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)与不同抑制性受体的表达水平,并进行相关性分析。方法回顾性选择2019年9月至2020年11月天津医科大学总医院血液科AA患者27例,其中男21例,女6例,年龄[M(Q_(1),Q_(3))]48(30,72)岁。健康对照者33名,其中男17名,女16名,年龄46(27,69)岁。通过流式细胞术检测AA患者及健康对照者外周血CD8^(+)T细胞中TOX、程序性细胞死亡受体‑1(PD‑1)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域‑3(TIM‑3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原‑4(CTLA‑4)、具有免疫球蛋白(Ig)和免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、穿孔素、颗粒酶B的表达水平。TOX表达水平与不同抑制性受体的相关性采用Pearson相关性分析。结果AA患者外周血CD8^(+)T细胞TOX、PD‑1、TIM‑3、CTLA‑4、TIGIT、穿孔素、颗粒酶B的表达水平分别为47.33%(41.47%,56.61%)、(30.61±12.37)%、(39.94±10.84)%、(6.21±3.40)%、(51.45±20.21)%、(71.32±22.46)%、(52.39±23.99)%,均高于健康对照组的27.32%(21.64%,46.96%)、(21.29±10.01)%、(21.11±3.00)%、(1.31±0.34)%、(30.80±13.40)%、(46.72±22.53)%、(21.75±16.43)%(均P<0.05)。CD8^(+)T细胞TOX的表达水平与PD‑1、TIM‑3、CTLA‑4、TIGIT、穿孔素、颗粒酶B的表达水平均呈正相关(r=0.49、0.65、0.70、0.54、0.58、0.48,均P<0.05)。结论AA患者外周血CD8^(+)T细胞TOX与不同抑制性受体的表达水平均高于健康对照组,且TOX表达水平与不同抑制性受体表达水平均呈正相关。

干扰TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞的构建及其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的构建干扰胸腺细胞选择相关高迁移率群体盒(TOX)基因联合抗CD38 CAR-T细胞,观察其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法采集健康志愿者外周血,分离单个核细胞(PBMC),提取原代T淋巴细胞。构建以shRNA技术靶向抑制TOX的抗CD38 CAR分子,分别命名为TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR,另设计一条不针对任何靶点的无意义RNA序列作为对照,命名为CD38 CAR分子。将分子酶切并连接逆病毒载体包装质粒pMFG,获得pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR和pMFG-MYC-CD38 CAR。将人原代T淋巴细胞分为CD38 TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组、CAR-T组,分别转导pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR和pMFG-MYCCD38 CAR质粒,获得CD38 CAR-T细胞、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T细胞和TOX-shRNA2-CD38 CAR-T细胞。采用RT-QPCR法检测三组细胞中TOX mRNA的相对表达量;记录三组细胞0~10 d体外培养生长倍数,观察细胞增殖能力。选取CD38高表达的人多发性骨髓瘤荧光素酶标记细胞RPMI-Luc、人Burkitt’s淋巴瘤荧光素酶标记细胞Raji-Luc作为靶细胞,与三组CAR-T细胞分别共培养48 h;另取三组CAR-T细胞单独培养作为对照,不加肿瘤细胞。采用流式细胞术检测三组CAR-T细胞表面CD69的表达效率,评价CAR-T细胞活化情况;对三组细胞进行CFSE染色,采用流式细胞术观察CAR-T细胞增殖能力;荧光素酶化学发光法观察CAR-T细胞在不同效靶比(1∶2、1∶4、1∶8)时对肿瘤细胞的杀伤效率;ELISA法检测三组CAR-T细胞上清中IFN-γ释放量;流式细胞术检测三组细胞表面PD-1表达量,评估CAR-T细胞的耗竭程度。结果 CD38 CAR-T组、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组、TOXshRNA2-CD38 CAR-T组的转导效率分别为41.51%、41.28%、44.84%,均超过40%。与CD38 CAR-T组比较,TOXshRNA2-CD38 CAR-T组TOX mRNA表达水平降低(P <0.05),TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组无明显变化(P>0.05)。三组CAR-T细胞体外培养0~10 d均稳定增殖,三组间生长倍数比较差异无统计学意义(P <0.05)。三组与肿瘤细胞共培养后,CD69表达效率均升高(P均<0.01)。与单独培养的CAR-T细胞相比,三组CAR-T细胞与Raji-Luc、RPMI-Luc细胞共培养后FITC信号左移,增殖加快,三组增殖能力比较无统计学差异(P> 0.05)。与CD38 CAR-T组相比,TOX-shRNA2-CD38 CAR-T组在不同效靶比时对肿瘤细胞的杀伤效率均提高,γ干扰素释放水平升高,细胞表面PD-1表达水平降低(P <0.05或<0.01),而TOX-shRNA1-CD38 CAR-T组与CD38 CAR-T组比较,肿瘤细胞的杀伤效率、γ干扰素释放水平、细胞表面PD-1表达水平均无统计学差异(P均>0.05)。结论成功构建了靶向抑制TOX基因联合抗CD38 CAR-T细胞,TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞能够有效抑制TOX表达;经肿瘤细胞激活后,其体外增殖活性及抗肿瘤能力显著增强,且TOX-shRNA-CD38 CAR-T细胞耗竭也得到改善。

T细胞耗竭发生机制及其在免疫治疗中的研究进展

肿瘤治疗是现今世界最主要的医学难题之一,据2019年肿瘤统计年鉴报道,世界约有176万肿瘤新发和60万死亡病例,肿瘤也是美国的第二大死亡原因。在肿瘤病程中,由于抗原的持续性刺激,CD8^(+)T细胞逐渐分化为耗竭T细胞,其特征是抑制性受体的积累、效应功能的降低和增殖能力的下降。由于T细胞耗竭对控制肿瘤发生与发展非常重要,近些年来,有关T细胞耗竭的研究发展迅猛,尤其是发现了PD-1^(+)TCF1^(+)CD8^(+)祖细胞群以及胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(thymocyte selection-associated high mobility group box,TOX)在T细胞耗竭表观遗传方面的重要性,这些内容对深入理解肿瘤免疫过程以及改善免疫治疗方案有着十分重要的意义。文章就T细胞耗竭的发生机制、表观遗传调控以及逆转方法的相关研究进展作一综述。

较低级别胶质瘤TOX基因表达水平与放疗敏感性的关联研究

目的探讨胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)基因表达与较低级别胶质瘤(LGG)患者放疗敏感性的关系。方法采用生物信息学研究方法,选取肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的474例LGG患者作为试验集(TCGA-474集),中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中的两个不同的遗传数据集(分别包括412例和171例患者)作为验证集(CGGA-412集和CGGA-171集)。根据是否接受放疗将患者分层,根据TOX基因在LGG中的表达水平分为TOX高表达组和低表达组,绘制患者生存曲线,采用log-rank检验对比分析TOX高表达组和低表达组患者的总生存(OS)和无进展生存(PFS)。结果TCGA-474集患者OS多因素分析显示TOX高表达是OS的保护因素(HR=0.061,95%CI为0.005~0.791,P=0.044)。按放疗与否分层并调整混杂因素后,TOX高表达组患者在TCGA-474集、CGGA-412集、CGGA-171集的HR(95%CI)分别为0.405(0.261~0.629)、0.581(0.418~0.806)和0.464(0.269~0.800),P值分别为<0.001、0.001、0.008。TCGA-474集的放疗患者中,TOX高表达组患者的OS(P<0.001)和PFS(P<0.001)均较低表达组延长,差异有统计学意义。TOX高表达组患者的OS获益在CGGA-412集(P<0.001)和CGGA-171集(P<0.001)均较低表达组延长,差异有统计学意义。结论TOX的高表达可能与LGG的放疗敏感性有关,可能是LGG放疗敏感性的一个基因标记。