胸腺输出功能的评价手段—T细胞受体重排删除环的定量分析

多年来 ,因缺乏合适的检测胸腺输出naiveT细胞的技术 ,未能明确胸腺输出功能。由于胸腺T细胞的分化始于T细胞受体 (TCR)基因的重排 ,在TCRα基因重排时 ,通过δRec和 ψJα基因片段重组形成染色体外DNA环而删除TCRδ基因 ,该删除环称为信号结合T细胞受体重排删除环 (sjTRECS)或TRECs。TRECs十分稳定 ,不扩增且随着细胞增殖而稀释 ,故近期研究认为对TRECs的定量检测可以直接地估计胸腺的输出功能。本文综述了TRECs定量分析在评价正常人和造血干细胞移植 ,血液肿瘤、HIV感染和自身免疫性疾病等等的胸腺输出功能中的作用。

造血干细胞移植患者动态监测胸腺输出功能的意义

目的观察造血干细胞移植患者胸腺近期输出功能的动态变化情况,分析其相关影响因素,从而了解移植后T细胞免疫重建情况。方法选择2007年1月~2012年6月于北京大学深圳医院接受造血干细胞移植的血液病患者41例,采用实时荧光定量PCR方法检测患者不同时期200μL外周血中T细胞受体重排DNA删除环（sjTREC）水平,计算每毫升血液中sjTREC拷贝数。同时检测32例年龄匹配的正常者外周血T细胞受体重排DNA删除环含量作为正常对照。比较患者造血干细胞移植后sjTREC随时间变化情况。结果 32例正常对照组外周血Log sjTREC/mL为3.78±0.22,它与年龄呈负相关（r=-0.59,P〈0.05）。41例移植患者移植前外周血sjTREC水平显著低于正常对照组,移植后外周血sjTREC进一步下降,移植6个月后TRECs逐渐升高,移植后1.5年基本恢复至移植前水平,移植后2.5年恢复至接近正常水平。反复化疗可使患者胸腺输出功能下降。不同年龄组患者移植后胸腺输出功能恢复差异无统计学意义（P〉0.05）。移植6个月后,自体造血干细胞移植组患者外周血sjTREC水平恢复快于异基因移植组（P〈0.05）,至移植后2年二者差异无统计学意义（P〉0.05）。移植1年后存在广泛型cGVHD的患者其外周血sjTREC水平下降,低于无cGVHD者（P〈0.05）。结论造血干细胞移植后T细胞免疫重建缓慢,并受多种因素影响。胸腺输出功能可作为评价移植后免疫重建的有效指标。

慢性粒细胞白血病患者胸腺输出功能与bcr-abl mRNA水平的关系

本研究了解慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者体内T细胞受体重排删除环(Tcell receptor rearrangement excision circles,TREC)的含量与bcr-abl mRNA水平的关系,进而明确CML患者的胸腺近期输出功能测定对疾病预后判断的意义。实时定量PCR检测15例CML-CP患者外周血TREC含量及bcr-abl融合基因转录本的水平,并追踪检测6例患者bcr-abl水平的变化。结果发现:在CML初发时患者外周血TREC含量与bcr-abl融合基因水平无明显的相关性;随访2年后,TREC含量高的患者bcr-abl水平下降幅度更大,而在接受造血干细胞移植的2例患者中,移植前TREC含量相对较高者,移植1年后连续3次均检测不到bcr-abl,另1例则检测到低水平的bcr-abl。结论:CML患者胸腺输出功能较高者,可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助。

造血干细胞移植术后患者的胸腺输出功能及T细胞免疫重建效果分析

目的探讨造血干细胞移植术(HSCT)后患者的胸腺输出功能及T细胞免疫重建状况。方法选择2011年6月至2015年6月在我院行HSCT治疗的30例恶性血液病患者作为研究对象。HSCT术后1个月、3个月、6个月、12个月分别检测外周血CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞水平,采用实时定量PCR方法检测T细胞受体重排DNA删除环(TREC)水平;对患者长期生存率(>5年)、急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率、慢性移植物抗宿主病(cGVHD)发生率、巨细胞病毒(CMV)感染率与TREC水平的关系进行Pearson相关性分析。结果 30例患者造血干细胞植入率为100%,HSCT术后均不出现排斥反应。HSCT术后100 d,发生aGVHD患者10例,表现为局部皮疹和瘙痒;术后100 d后,又出现局部cGVHD患者5例;术后6个月,出现单纯疱疹感染9例、出血性膀胱炎7例、EB病毒(EBV)感染26例、CMV感染20例、霉菌感染8例;HSCT术后12个月,新增单纯疱疹感染2例。HSCT术后1个月后,患者CD3^+、CD4^+、CD8^+均处在较低水平。CD3^+水平在术后第3个月开始稳步上升,术后6个月后逐步达到正常水平;CD4^+水平在术后1~3个月持续下降,术后3个月后开始逐步升高;CD8^+水平在术后第1个月开始稳步上升。HSCT术后1~3个月,患者TREC总体水平较低;术后6个月,TREC水平开始显著回升;术后12个月,TREC水平达(148.61±68.34)copies/10~5 PBMNCs。Pearson相关性分析结果显示,患者长期生存率(>5年)与TREC水平呈正相关(r=0.386),cGVHD发生率与TREC水平呈负相关(r=-0.847),aGVHD发生率、CMV感染率与TREC水平无明显相关关系。结论造血干细胞移植术后患者需要较长的时间进行免疫重建,术后1年其中枢免疫功能未完全恢复。TREC水平恢复越好患者的胸腺输出功能越好,患者长期生存率越高,cGVHD发生率越低。

粒细胞集落刺激因子对急性辐射损伤小鼠胸腺输出功能的影响

目的粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是急性辐射损伤治疗的首选药物,但其在促进粒系造血恢复的同时能否促进辐射损伤后中枢免疫功能恢复尚不清楚。文中以亚致死量辐射损伤小鼠为研究对象,观察G-CSF对急性辐射损伤后胸腺输出功能的影响。方法雌性BALB/c小鼠50只给于6.0 Gy60钴一次性全身照射后随机均分为2组。G-CSF组小鼠给予重组人G-CSF 100μg/(kg.d)皮下注射,连续14 d;对照组小鼠给予等体积磷酸盐缓冲液(PBS)皮下注射,连续14d。照后30d、60d分别利用流式细胞仪及荧光定量PCR技术检测外周血中初始T淋巴细胞比例以及胸腺细胞中T细胞受体重排删除环(T cell receptor rearrangement excision circles,TRECs)拷贝数,判断胸腺输出功能。结果照后30 d,G-CSF组小鼠外周血中初始T淋巴细胞比例G-CSF组(3.5±0.9)%与对照组(1.3±0.8)%比较差异有显著性统计学意义,P≤0.05;胸腺信号结合T细胞受体删除环(signal joint T cell receptor rearrangement excision circles,sjTRECs)拷贝数G-CSF组(6450±783)均明显高于对照组(3630±595),P<0.05。但照后60 d 2组上述检测指标差异无统计学意义。结论 G-CSF可在急性辐射损伤后早期增加胸腺输出功能,促进中枢免疫重建。

重度苯中毒患者胸腺输出近期功能明显低下

本研究目的在于分析重度苯中毒患者外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环 (T cellreceptorexci sionDNAcircle ,TREC)的含量 ,从而了解其初始 (naive)T细胞的含量和胸腺近期输出功能。利用实时定量PCR和TaqMan方法检测 8例重度苯中毒患者和 16例正常人外周血单个核细胞 (PBMNC)中TREC的水平。结果显示正常人中TREC含量为 :6 .6 9± 4 .79 10 0 0PBMNC ;而重度苯中毒患者则为 1.0 3± 0 .4 4 10 0 0PBMNC ,显著低于正常人TREC水平 (P <0 .0 1) ,并持续苯中毒的全过程 ,即使在外周血血象基本恢复正常时 ,TREC水平仍处于较低状态。结论 :重度苯中毒患者胸腺近期输出功能明显低下 ,苯中毒明显损伤T细胞免疫功能。

接苯工人胸腺近期输出功能和外周血T细胞亚群变化

目的分析接苯工人外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环(TRECs)和T淋巴细胞亚群的含量,了解接苯后工人胸腺近期输出功能和外周T淋巴细胞亚群变化,为接苯后机体细胞免疫改变提供资料。方法利用间接免疫荧光法检测健康人和接苯工人外周血单个核细胞中CD3+,CD4+,CD8+的含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和TaqMan方法检测标本外周血单个核细胞中TRECs的含量。结果在接苯工人外周血白细胞总数正常情况下,接苯组CD8+含量显著增加,CD4+/CD8+比值为(1.13±0.78),低于健康人(1.43±0.25)(P<0.05)。每1000个外周血单个核细胞中接苯组与对照组TRECs含量分别为(3.90±3.58)和(7.39±6.83),两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期低剂量接苯可能引起一些工人的胸腺近期输出功能低下,导致机体细胞免疫功能障碍。

胸腺近期输出功能测定在评价细胞免疫功能重建中的应用

T细胞受体重排删除环 (TRECs )是T细胞受体基因重排过程中删除的DNA环 ,可作为胸腺近期输出功能的指标 ,本文综述其在造血干细胞移植、HIV - 1感染和AIDS患者抗逆转录病毒治疗。

不同接苯时间苯中毒患者胸腺近期输出功能变化

为分析职业性苯中毒工人外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的含量,了解苯中毒工人胸腺近期输出功能变化,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和TaqMan方法检测苯中毒和健康人外周血单个核细胞中TRECs的含量。结果显示,TRECs含量苯中毒观察对象2·97±1·31、轻度苯中毒1·73±1·11、中度苯中毒2·28±1·44、重度苯中毒1·91±1·95,各组患者每1000个外周血单个核细胞中TRECs含量均明显低于健康组7·39±6·83(P<0·05),轻度和重度苯中毒组TRECs含量显著低于苯中毒观察对象组(P<0·05)。重度苯中毒组接苯时间>3的工人TRECs含量显著低于接苯时间≤3年者,苯中毒观察对象组接苯时间>5年的工人TRECs含量显著低于≤5年者(P<0·05)。提示苯中毒患者胸腺近期输出功能低下。

炎症性肠病患者胸腺近期输出功能变化

目的:研究炎症性肠病(IBD)患者外周血T细胞受体删除DNA环(TRECs)的含量,了解IBD患者胸腺近期输出功能变化,探讨其在IBD发病中的意义。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime PCR)检测20名健康人、15例活动期克罗恩病(CD)患者和22例活动期溃疡性结肠炎(UC)患者外周血T细胞中TRECs的含量。结果:TRECs含量CD患者13.48±10.59、UC患者14.67±11.12,各组患者每1000个外周血T细胞中TRECs含量均明显高于健康组8.32±7.02(P均<0.05)。结论:IBD患者幼稚T细胞的含量显著高于正常人,提示IBD患者胸腺近期输出功能在炎症活动期明显增强。

粒细胞集落刺激因子对亚致死剂量照射后小鼠胸腺细胞周期及近期输出功能的影响

本研究探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对急性辐射损伤小鼠胸腺细胞的细胞周期、凋亡及近期输出功能的影响。雌性BALB/c小鼠40只,给予6 Gy 60Coγ线1次性全身照射后随机均分为2组。G-CSF组小鼠给予重组人G-CSF 100μg/(kg.d),皮下注射,连续14天;对照组小鼠给予等体积磷酸盐缓冲液,皮下注射,连续14天。用流式细胞仪检测照后72小时内胸腺细胞的细胞周期及凋亡细胞比例;应用荧光定量PCR方法检测照后30和60天105个胸腺细胞中T细胞受体重排删除环(sjTREC)拷贝数,以判断胸腺细胞输出功能。结果表明,G-CSF在照后6小时即可使胸腺细胞出现G0/G1期阻滞,G-CSF组vs对照组为(82.0±5.0)%vs(75.9±2.8)%(p<0.05),S期细胞比例下降,G-CSF组vs对照组为(10.2±4.8)%vs(15.7±2.3)%(p<0.05),但对G2/M期细胞比例影响不大。胸腺细胞受照后6小时即出现明显凋亡,12小时达高峰。G-CSF组在照后6及12小时胸腺细胞凋亡率分别为(11.5±2.4)%和(15.5±3.3)%,而对照组分别为(16.5±2.2)%和(22.6±0.7)%,两时间点统计学差异明显(p<0.05)。荧光定量PCR结果显示,照后30天G-CSF组胸腺细胞sjTREC拷贝数明显高于对照组(p<0.01),但照后60天两组胸腺细胞sjTREC拷贝数无统计学差异。结论:G-CSF可调节急性辐射损伤后胸腺细胞周期,减少胸腺细胞凋亡,增加胸腺细胞输出功能,促进中枢免疫恢复。

B淋巴细胞肿瘤患者胸腺近期的输出功能

本研究了解B细胞肿瘤患者胸腺近期输出naiveT细胞的水平,以评价其T细胞免疫潜能。利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测61例B细胞肿瘤患者(成人B-ALL20例,儿童B-ALL6例,B-CLL4例,B-NHL17例,MM14例)外周血单个核细胞(PBMNC)中T细胞受体重排删除DNA环(T-cell receptor rearrangement excision circles,TREC)的含量,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TREC水平。5例ALL-CR病人和17例正常人外周血作为对照。实验结果显示,正常人外周血中TREC拷贝数为3.76±3.42/1000PBMNC和5.87±4.96/1000CD3+细胞,而各B细胞肿瘤组的TREC水平均显著低于正常人水平,其TREC水平在成人B-ALL为0.53±1.52拷贝/1000PBMNC和2.01±3.93拷贝/1000CD3+细胞(p=0.0005和p=0.0123),在B-CLL为0.11±0.15拷贝/1000PBMNC,0.23±0.27拷贝/1000CD3+细胞(p=0.0015和p=0.0381),在B-NHL为0.71±1.34拷贝/1000PBMNC(p=0.0017),在MM为0.53±0.90拷贝/1000PBMNC(p=0.0018)。ALL-CR组TREC水平同样低于正常人水平,儿童B-ALL组TREC水平明显高于成人组。结论:各类B细胞肿瘤胸腺近期输出naiveT细胞功能均明显降低,个体差异较大,在病人达到完全缓解期时,胸腺近期输出功能仍没有得到恢复,提示对病人有动态观察的必要性。

实时定量PCR分析CML患者胸腺近期输出功能

目的 了解慢性粒细胞白血病 (CML)患者CD3+ 、CD4 + 和CD8+ 细胞中T细胞受体重排删除DNA环 (TRECs)的含量 ,从而推测CML患者的胸腺近期输出功能。方法 利用实时定量PCR(Taq Man)方法检测 8例CML患者外周血单个核细胞、3例CML患者CD4 + 和CD8+ 细胞中TRECs的水平。并根据外周血中CD3阳性率计算CD3+ 细胞中TRECs水平。 9例正常人外周血作为对照。结果 CML患者中TRECs含量为 0 .1± 0 .2 2 / 10 0 0T细胞 ,明显低于正常人TRECs水平 (6 .84± 4 .71/ 10 0 0T细胞 ,P <0 .0 1)。其中 5例患者外周血单个核细胞中未能检测到TRECs ,经分选CD4 + 和CD8+ 细胞后 ,2例可以检测到低水平的TRECs。结论 本研究首先报道了CML患者TRECs水平情况 。

自体造血干细胞移植后的胸腺近期输出功能

目的:了解血液病患者接受自体造血干细胞移植(auto-HSCT)后外周血中的T细胞受体重排删除环(TRECs)水平,从而了解其胸腺近期输出功能和T细胞免疫重建情况。方法:采用实时定量PCR法检测9例血液病患者经auto-HSCT治疗后外周血单个核细胞(PBMNCs)中的TRECs水平;22例正常人外周血样本作为对照。结果:PBMNCs中的TRECs水平有着较大的个体差异,年龄与PBMNCs中的TRECs水平呈负相关;auto-HSCT组的每1 000个PBMNCs中的TRECs平均拷贝数(2.533±4.194)明显低于正常组(4.367±3.626)(P<0.05),但部分病例的TRECs水平已基本达到正常水平。结论:在一定时间内,auto-HSCT后的胸腺近期输出功能仍较低,不同个体T细胞免疫重建时间存在差异。

抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群的胸腺近期输出功能初步探讨

目的观察抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量,从而推测其胸腺近期输出功能。方法利用实时荧光定量PCR方法检测30例抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群及22例正常人PBMCs中TRECs含量。结果抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群中TRECs含量为(5.67±1.55)cop ies/103PBMCs,与正常人TRECs水平(6.11±2.11)cop ies/103PB-MCs无差异(P>0.05)。结论抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群TRECs水平情况显示其胸腺近期输出功能与正常人比较无差异。

尿毒症维持性血液透析近期胸腺输出功能变化研究

目的评估尿毒症维持性血液透析(MHD)患者近期胸腺输出nave T细胞的情况。方法对郑州大学附属肿瘤医院2010年10月至2011年10月收治的15例MHD患者利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测其透析前后外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的含量,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3+T细胞中TRECs水平。以10例年龄相匹配的正常人外周血作为对照。结果与正常人外周血中TRECs拷贝数相比,15例MHD者首次透析前的TRECs均显著低下,分别为(0.48±0.39)拷贝/1000 PBMCs和(1.03±0.57)拷贝/1000CD3+T细胞(P值分别为0.0014和0.0067)。而透析2～6个月后外周血中的TRECs值差异较大,平均为(0.41±0.36)拷贝/1000 PBMCs和(1.33±1.46)拷贝/1000 CD3+T细胞(P值分别为0.0008和0.019),仍明显低于正常水平,与首次透析前的水平相比,差异无统计学意义。结论 MHD患者首次透析前及透析2～6个月后胸腺近期输出nave T细胞功能均明显低下,胸腺近期输出功能低下是导致细胞免疫功能缺陷的根本原因之一。

实时荧光定量PCR分析慢性丙型肝炎患者胸腺近期输出功能

目的观察慢性丙型肝炎(CHC)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量,从而推测CHC患者的胸腺近期输出功能,并且比较TRECs含量与HCV载量的关系。方法利用实时荧光定量PCR方法检测22例CHC患者及16例正常人PBMCs中TRECs含量,用RT-PCR方法结合荧光探针的检测技术检测CHC组外周血血清中的HCVRNA。结果CHC患者中TRECs含量为(5.52±1.87)copies/103PBMCs,低于正常人TRECs水平(7.19±2.42)copies/103PBMCs,P<0.05;TRECs含量与HCV载量直线相关分析r=-0.427,P<0.05。结论CHC患者TRECs水平低于正常人,显示其胸腺近期输出功能明显降低,且与HCV载量呈负相关性。

原发性血小板减少性紫癜患者胸腺近期输出功能状态

目的:了解原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者胸腺近期输出功能的状态,评价其T细胞潜能。方法:采用实时定量PCR(TaqM an)方法检测15例ITP患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除DNA环(TRECs)的含量,17例正常人作为对照。结果:正常人外周血中每1 000个PBMCs中TRECs拷贝数为(3.76±3.42),ITP患者TRECs水平变化较大[每1000个PBMCs中TRECs拷贝数为(2.60±2.99)],4例病人未能检测到TRECs,病人平均TRECs水平与正常人的差异没有显著性(P>0.05),女性病人TRECs水平略高于男性(P=0.499),但无统计学意义。结论:多数ITP患者外周血初始T细胞水平和胸腺近期输出功能保持正常水平。

定量检测T细胞受体重排删除DNA环含量评价急性非淋巴细胞白血病患者胸腺近期输出功能

目的检测急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者T细胞受体重排删除DNA环(signaljoint T-cell receptor exc ision DNA c irc les sjTRECs,TRECs)的含量,从而探讨患者的初始型naive T细胞水平和胸腺近期输出功能特点。方法利用实时定量PCR(TaqM an)方法,检测77例ANLL患者外周血单个核细胞(PBMC)TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平。14例ANLL缓解期患者和14例正常人外周血作为对照。结果ANLL患者外周血中TRECs含量为(0.43±0.92)拷贝/1 000 PBMCs,(2.02±3.25)拷贝/1 000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平[(4.10±3.65)拷贝/1 000 PBMCs和(6.84±4.71)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0001]和缓解期患者[(2.19±2.49)拷贝/1 000 PBMCs和(6.30±7.13)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0005]。各亚型ANLL患者的TREC水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论绝大多数ANLL型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,缓解期患者的胸腺近期输出功能有一定程度恢复。

B-ALL患者胸腺输出TCR Vβ亚家族nave T细胞分析

目的了解B细胞-急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族23种信号T细胞受体删除DNA环（sjTRECs）的存在情况，从而了解胸腺近期输出各TCR Vβ亚家族naive T细胞的功能。方法利用半巢式PCR分别扩增10例B-ALL患者外周血单个核细胞DNA中的23种Vβ～Dβ1 sjTRECs，10例正常人作为对照。结果TCR Vβ亚家族sjTRECs在大部分正常人和部分B-ALL患者中均可检测到，与正常人比较，B-ALL病人的Vβ24～Dβ1 sjTRECs出现频率比正常人高，且有统计学意义（80％：30％，P=0．0285），另有18个家族的Vβ～Dβ1 sjTRECs比正常人低，其中在Vβ1（30％，P=0．0285）、Vβ12（20％，P＝0．0285）、Vβ13（40％，P=0．0043）、Vβ15（20％，P=0．0022）和Vβ18（20％，P=0．0089）5个亚家族sjTRECs出现频率的差异有统计学意义。结论B-ALL病人胸腺输出大多数Vβ亚家族naive T细胞功能低于正常人。