Aire对胸腺髓质上皮细胞异位基因表达影响的研究

目的探讨自身免疫调节因子(Autoimmune regulator,Aire)对胸腺髓质上皮细胞(Medullary thymic epithelial cells,mTECs)异位基因表达的影响。方法原代培养高纯度C57BL/6小鼠胸腺上皮细胞,脂质体法转染pEGFPC3/Aire质粒,RT-PCR法检测mTECs表达Aire及3种常见异位基因mRNA的水平。结果(1)体外培养9天后胸腺上皮细胞占85%左右,转染pEGFPC3/Aire质粒可获得较高转染效率。(2)mTECs中Aire和异位基因表达随培养时间逐渐减弱,至第11天都完全消失。(3)Aire能在mTECs培养早期促进异位基因短期表达。(4)胸腺细胞可延长Aire-mTECs上异位基因表达时间。结论(1)Aire对mTECs异位基因表达有明显的促进作用;(2)胸腺细胞是Aire和异位基因上游激活信号的重要来源。

胸腺髓质上皮细胞干细胞对胸腺发育的影响

来源于胸腺双能祖细胞的胸腺髓质上皮细胞干细胞(medullary thymic epithelial cell stem cells, mTECSCs),在胸腺发育过程中的胚胎早期阶段既可能发生分化,又可能在胎儿出生后维持胸腺髓质上皮细胞(medullary thymic epithelial cells, mTECs)的再生,充分发挥组织干细胞的功能,确保终身外周血中央型记忆T细胞自身耐受。mTECSCs对胸腺的发育起着重要的作用和影响,得到很多学者的关注。现就mTECSCs对胸腺功能、生理性退化及胸腺衰老和免疫稳态等发育过程中的作用和影响作一概述,并探讨其在胸腺相关疾病治疗方面的潜在价值。

识别胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞的单链抗体的筛选

目的 利用噬菌体展示技术寻找胸腺基质细胞表面的新抗原。方法 用培养的胸腺基质细胞系MTDC作为靶抗原富集初级噬菌体抗体库 ,从经过富集后的次级抗体库中挑选克隆 ,制备单链抗体 ,并在冰冻切片及培养的细胞系上检测抗体的特异性。结果 从经 4轮富集的次级抗体库中挑选到一个新的克隆。用此克隆制备的单链抗体可同时辨认胸腺髓质上皮细胞亚群和胸腺树突状细胞亚群。结论 胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞均具有异质性 ,同时噬菌体展示技术可以作为寻找细胞表面新分子的强有力工具。

狼疮肾炎小鼠模型的诱导及胸腺髓质上皮异位基因在SLE的作用研究

目的:通过慢性移植物抗宿主病的方法诱导狼疮肾炎小鼠模型,狼疮肾炎模型经甲强龙治疗后小鼠一般状态和胸腺髓质上皮细胞(m TECs)2种异位基因的改变,探讨异位基因在SLE中的作用。方法:采用慢性移植物抗宿主病的方法诱导狼疮肾炎小鼠模型,分为对照组、模型组及模型治疗组。观察甲强龙治疗后SLE小鼠尿蛋白变化,肾脏及唾液腺病理的改变,检测小鼠m TECs2种异位基因(唾液蛋白2、组织蛋白酶L)m RNA的水平,观察肾脏、唾液腺的病理变化。结果:慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,c GVHD)的方法诱导出狼疮肾炎模型,模型组2种异位基因水平均较对照组降低,异位基因相关器官出现唾液腺炎及全身改变,治疗组异位基因水平升高,狼疮症状及病理损害明显改善。结论:慢性移植物抗宿主病的方法可成功诱导出狼疮肾炎模型,SLE小鼠异位基因甲强龙治疗后的升高,表明中枢耐受异常的恢复为狼疮好转的原因。

胸腺上皮细胞的起源与分化

胸腺提供复杂的微环境来调节T细胞的存活、分化、选择和迁移，是T细胞发育、分化和成熟的场所也是自身免疫耐受的中心。胸腺上皮细胞包括胸腺皮质上皮细胞和髓质上皮细胞，其来源于内胚层，并由胸腺上皮祖细胞分化而来。胸腺上皮细胞的分化空间结构的建立有赖于转录因子和信号通路分子在胸腺上皮细胞不同时段复杂的分子调控。胸腺上皮细胞成熟过程也是胸腺上皮细胞一系列特异性表面标记分子的变化过程，对胸腺上皮细胞特异标记分子的研究是分析胸腺上皮细胞复杂分化过程的重要工具。本文重点探讨胸腺上皮细胞起源发展模型及分化过程中分子调控作用，以期更好的理解胸腺上皮细胞如何成为能够支持T细胞分化的特异哺育者。

胸腺上皮细胞中雌激素诱导lncRNA的鉴定分析及表达载体构建

为研究胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)中雌激素(estradiol,E2)对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达的调节作用,本研究首先培养小鼠胸腺髓质上皮细胞系1(medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1),经50 nmol/L E2作用24 h后,观察对细胞表型变化的影响,并用CCK-8试剂盒检测细胞活力;提取细胞总RNA,运用实时荧光定量PCR技术验证E2对lncRNA-2410006H16Rik表达的调节作用;最后运用RT-PCR技术扩增其目的基因,构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik重组过表达载体。结果显示,50 nmol/L E2能够明显抑制MTEC1的增殖,且相较于对照组细胞,50 nmol/L E2处理组细胞的D450 nm值极显著降低(P<0.01),表明其细胞活力极显著下降。实时荧光定量PCR结果显示,在E2作用下,lncRNA-2410006H16Rik在MTEC1细胞中的表达极显著上调(P<0.01),约是对照组的2倍,与高通量测序结果一致。经RT-PCR、双酶切及测序结果分析显示,试验成功构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik表达载体。结果表明,TECs中lncRNA-2410006H16Rik的表达与E2作用密切相关,为后续在细胞水平上进一步验证lncRNA-2410006H16Rik的调节功能奠定了基础。

STZ诱导小鼠糖尿病模型中胸腺异位基因表达的研究

目的探讨胸腺异位基因表达与自身耐受及自身免疫病的相互关系。方法采用链脲佐菌素(STZ)诱导昆明小鼠糖尿病作为动物模型;利用RT-PCR方法检测小鼠胸腺异位基因表达水平。结果1型糖尿病(IDDM)小鼠胸腺的异位基因表达水平明显低于对照组小鼠。结论异位基因表达水平降低可能是引起IDDM的重要原因。

强力霉素抑制丝裂霉素诱导的MTEC1细胞凋亡及其蛋白质组初步分析

目的:探讨强力霉素(doxycycline,Dox)保护胸腺上皮细胞的作用及其机制,为进一步研究Dox的免疫调节作用奠定基础。方法:利用光学显微镜观察Dox对丝裂霉素(mitomycin,MMC)诱导MTEC1凋亡的影响,同时采用Hochest33342、PI单染、Annexin V和PI双染确认其作用,最后利用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析了SAX2芯片捕获的Dox作用前后的差异蛋白质。结果:通过形态学观察、Hochest33342、PI单染及Annexin V和PI双染发现Dox确实能保护MTEC1抵抗丝裂霉素诱导的细胞凋亡。随后采用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析SAX2芯片捕获蛋白,发现Dox能调控15种蛋白,其中上调8种,下调7种。结论:Dox具有保护MTEC1,抑制MMC诱导的细胞凋亡作用,并对MTEC1的蛋白表达有调控作用。

益气解毒复方含药血清对胸腺增生型重症肌无力mTEC和Treg细胞增殖的影响

目的:探讨益气解毒复方含药血清对胸腺增生型重症肌无力(MG)患者胸腺髓质上皮细胞(mTEC)和调节性T细胞(Treg)增殖的影响。方法:采用血清药理学方法,将35只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为益气解毒复方低、中、高剂量组,空白组,强的松组,每组7只。大鼠连续灌胃1周,制备上述各组含药血清。利用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法观察不同浓度益气解毒复方含药血清对mTEC和Treg细胞增殖的作用,并通过共同培养方式观察mTEC及益气解毒复方含药血清对Treg细胞增殖的作用。结果:胸腺细胞经培育,使用mTEC特征性标记荆豆凝集素Ⅰ(UEAI)做流式检测阳性率均值为92.54%。采用磁珠分选Treg细胞,多次磁珠分选后的Treg细胞纯度高达92%,mTEC和Treg细胞均呈较高阳性率表达,细胞为mTEC和Treg细胞,细胞纯度符合后续实验的要求。益气解毒复方含药血清体积分数2.5%~15%时,对mTEC和Treg细胞均有抑制作用,益气解毒复方含药血清浓度≥20%时对细胞的增殖有促进作用,且随作用的时间延长,含药血清对细胞的增殖的促进作用越为明显。培养48 h后的结果显示,与空白组比较,强的松组和益气解毒复方低剂量组差异无统计学意义,中、高剂量组细胞增殖抑制率显著降低(P<0.01)。与mTEC共同培养的Treg细胞,与空白组比较,强的松组、益气解毒复方低剂量组Treg细胞增殖抑制率差异无统计学意义,中、高剂量组细胞增殖抑制率显著降低(P<0.01)。结论:益气解毒复方含药血清能够影响胸腺增生型MG患者mTEC和Treg细胞的增殖,独立培养MG患者的Treg细胞相比,与mTEC共同培养的MG患者Treg细胞增殖具有促进作用,提示mTEC能够调控Treg细胞的增殖,且这种作用在予以益气解毒复方含药血清干预之后更为明显,说明益气解毒复方对Treg细胞的干预,可以通过对mTEC的治疗作用产生,这可能是益气解毒复方治疗MG的作用机制之一。

自身免疫调节因子AIRE借助于ATF7ip-MBD1抑制复合体来诱导免疫耐受

自身免疫调节因子AIRE（autoimmune regulator,AIRE）是一种转录因子。Aire发生变异可导致人类出现APECED（autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy）疾病,患者表现为多种内分泌器官的特异性自身免疫性破坏,另外还有慢性皮肤黏膜念珠菌病和外胚层退行性病变等。AIRE-/-小鼠具有与APECED患者相似的自身免疫缺陷。2002年,Mark Anderson教授第一次明确了AIRE可以调节多种组织特异性抗原（TSA）在胸腺髓质上皮细胞（mTECs）的转录,从而启动阴性选择,维持T细胞的中枢耐受,解释了单一基因的突变却导致了多器官的免疫性损伤。

组织特异抗原异位表达与免疫耐受

诱导和维持T细胞耐受是免疫系统区分自我和非我的关键。自身免疫调节因子(autoimmune regulator,AIRE)作为转录因子,在胸腺髓质上皮细胞中可驱动一系列组织特异抗原基因的表达,从而在诱导中枢免疫耐受的过程中发挥重要作用。外周免疫耐受的机制复杂一些,清除耐受是其重要机制之一。外周淋巴结的基质细胞可表达部分组织特异抗原,递呈给T淋巴细胞,激活并最终清除它。中枢免疫耐受和外周免疫耐受机制可清除潜在的自身反应性T淋巴细胞,维持对自身组织耐受。一旦免疫耐受被打破,将发生自身免疫反应和自身免疫疾病。

Medullary thymic epithelial cells,the indispensable player in central tolerance

Crosstalk between thymocytes and thymic epithelial cells is critical for T cell development and the establishment of central tolerance.Medullary thymic epithelial cells(mTECs) play important roles in the late stage of T cell development,especially negative selection and Treg generation.The function of mTECs is highly dependent on their characteristic features such as ectopic expression of peripheral tissue restricted antigens(TRAs) and their master regulator-autoimmune regulator(Aire),expression of various chemokines and cytokines.In this review,we summarize the current understanding of cellular and molecular mechanisms of mTEC development and its functions in T cell development and the establishment of central tolerance.The open questions in this field are also discussed.Understanding the function and underlying mechanisms of mTECs will contribute to the better control of autoimmune diseases and the improvement of immune reconstitution during aging or after infection,chemotherapy or radiotherapy.