泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并PCR扩增河北平山株系PaWBPs和江西吉安株系PaWBJan的tmk基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明:从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3;PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%;tmk-b基因为单一序列,两株系的tmkb核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。

泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%;而Pa WBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的p ET28a原核表达载体,对Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2 3种蛋白进行了原核表达,经Ni-NTA柱纯化后,利用双酶法进行了胸苷酸激酶催化活性测定,结果表明,Pa WBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性,为85.96±0.74 U·mg-1,而Pa WBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。本文为进一步研究胸苷酸激酶在植原体繁殖过程中的作用机理奠定了基础。

小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶基因(tmk)的分离、原核表达及酶活性分析

【目的】克隆、表达小麦蓝矮病(WBD)植原体胸苷酸激酶基因(tmk),并分析酶活性,进一步研究胸苷酸激酶在植原体感染宿主及繁殖过程中的功能和作用机理,更好地防治植原体病害。【方法】PCR方法扩增tmk基因并进行序列分析,连接pET30a(+)表达载体后原核表达,经Ni-NTA柱层析纯化后进行酶催化活性分析。【结果】首次从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出胸苷酸激酶基因(tmk),该基因包含tmk-1和tmk-2两种,大小分别为630bp和624bp,其编码的氨基酸序列均包含3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区。表达的融合蛋白TMK-1活性极低,酶活仅16.4U/mg,而TMK-2酶活高达112.41U/mg,且其最适催化条件为32℃、pH7.3、1.5mmol/LMg2+和1mmol/LATP。【结论】分析了胸苷酸激酶活性中心的一级结构序列及其催化活性随条件变化而改变的性质,为深入研究小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶在侵染寄主及其在宿主体内增殖的转录性质奠定基础。

全反式维甲酸增强携单纯疱疹病毒胸苷酸激酶基因的超声微泡对SMMC-7721细胞的旁观者效应

目的观察经全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导后,单纯疱疹病毒胸苷酸激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)对人肝癌细胞SMMC-7721旁观者效应的影响。方法免疫组化法观察经全反式维甲酸诱导前后SMMC-7721细胞连接蛋白Cx32的表达;将含有HSV-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面上,采用超声辐照转染并用倒置显微荧光镜及RT-PCR观察TK基因的转入及表达;MTT法观察经全反式维甲酸诱导后HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应。结果经全反式维甲酸诱导后SMMC-7721细胞膜上Cx32表达明显增加,而胞质内仅少量表达;通过超声辐照后HSV-TK基因可顺利转入SMMC-7721细胞中并稳定表达;与对照组相比,经全反式维甲酸诱导组可明显提高HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应(P<0.05)。结论全反式维甲酸可提高SMMC-7721细胞中连接蛋白Cx32的表达且能正确定位于细胞膜上,这可能与其能增强HSV-TK/GCV系统对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应有关。

从TCMSP中药数据库中筛选猴痘病毒胸苷酸激酶抑制剂

目的:运用虚拟筛选技术从中药数据库中筛选猴痘病毒胸苷酸激酶潜在的中药小分子抑制剂。方法:基于已公布的猴痘病毒胸苷酸激酶序列,利用同源模建技术构建猴痘病毒胸苷酸激酶三维结构,运用基于对接的虚拟筛选技术进行多轮筛选,包括高通量虚拟筛选、标准精度虚拟筛选、高精度虚拟筛选、Prime MMGBSA结合自由能筛选等。结果:筛选出了15个对猴痘病毒胸苷酸激酶具有潜在抑制活性的化合物,并分析了化合物MOL002468,MOL009538,MOL000416,MOL009237与胸苷酸激酶的结合模式,包括氢键、疏水相互作用、共轭和盐桥等受体-配体相互作用。结论:成功构建猴痘病毒胸苷酸激酶的虚拟筛选策略,发掘可用于预防、治疗猴痘病毒的药物,促进传统中药数据库的进一步开发和利用。

RV-HSV-TKc/GCV治疗脑胶质瘤效果及其影响因素

目的研究应用逆转录病毒介导中国单纯疱疹病毒TK基因治疗系统(RV-HSV-TKc/GCV)治疗脑胶质瘤的可行性及其影响因素。方法通过体外和大鼠实验,观察转TKc细胞在治疗中的量效关系;转基因方式对疗效的影响;基因治疗细胞在瘤内的分布;治疗动物的肿瘤免疫反应。结果①TKc胶质瘤细胞对GCV的敏感浓度>0.01μg/ml,PLCTKcSN细胞与胶质瘤细胞混合培养120h较混育24h的GCV敏感性高,在GVC有效杀伤范围内,基因治疗细胞与瘤细胞数量比值>1.0;②3种方式的体内治疗结果表明TKc/GCV具有一定抑制肿瘤生长作用;③接种后第5、10、15天的针道周围可见有大量TK表达阳性细胞,距针道5mm处TK阳性细胞则难以见到,与肿瘤交界的正常脑组织无TK阳性细胞;④治疗后长期生存大鼠5只再次接种瘤细胞28d后剖检,2只未见肿瘤生长,3只有肿瘤生长但明显小于对照组;实验组NK活性和ADCC效应高于对照组。结论在治疗细胞数量足够的前提下TKc/GCV基因治疗系统对大鼠脑胶质瘤有控制生长作用;该系统具有一定调节体内主动免疫效能。治疗细胞的基因转导能力,在瘤内的分布局限性,GCV局部浓度和机体的免疫状态是影响该基因治疗效果的主要因素。

子宫内膜癌患者血清检测VEGF与TK1的临床应用

目的测定子宫内膜癌患者血管内皮生长因子（VEGF）、胸苷酸激酶（TKl）的水平，探讨二者在子宫内膜癌患者血清的浓度水平。方法选取2007年6月至2012年5月在枣庄市立医院妇科住院的子宫内膜癌患者（经病理证实）共86例，按国际妇产科联盟（FIGO）2006年的标准进行手术病理分期及病理分级。正常对照组31例，为女性健康查体者，排除合并肿瘤及其他感染性疾病等。结果31例健康对照组血清中VEGF和TKl水平分别为（884-32）pg／ml和（2．94-1．3）pmol／L，而86例子宫内膜癌患者血清的VEGF和TKl水平为（8094-214）pg／ml和（8．04-2．3）pmol／L，明显高于健康对照组（P〈0．01）。且二者的血清浓度与患者的病理分期呈正相关。结论血VEGF和TK1的水平与子宫内膜癌患者有密切的关系，可作为其发生、发展和预后的判定指标。在子宫内膜癌生长过程中，随着TK1表达量由低到高，VEGF促进肿瘤细胞生长的作用增强。把这两种指标与临床指标进行分析，可作为子宫内膜癌患者的早期诊断以及判断术后预后提供相关的理论基础和依据。