小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶基因(tmk)的分离、原核表达及酶活性分析

【目的】克隆、表达小麦蓝矮病(WBD)植原体胸苷酸激酶基因(tmk),并分析酶活性,进一步研究胸苷酸激酶在植原体感染宿主及繁殖过程中的功能和作用机理,更好地防治植原体病害。【方法】PCR方法扩增tmk基因并进行序列分析,连接pET30a(+)表达载体后原核表达,经Ni-NTA柱层析纯化后进行酶催化活性分析。【结果】首次从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出胸苷酸激酶基因(tmk),该基因包含tmk-1和tmk-2两种,大小分别为630bp和624bp,其编码的氨基酸序列均包含3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区。表达的融合蛋白TMK-1活性极低,酶活仅16.4U/mg,而TMK-2酶活高达112.41U/mg,且其最适催化条件为32℃、pH7.3、1.5mmol/LMg2+和1mmol/LATP。【结论】分析了胸苷酸激酶活性中心的一级结构序列及其催化活性随条件变化而改变的性质,为深入研究小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶在侵染寄主及其在宿主体内增殖的转录性质奠定基础。

泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并PCR扩增河北平山株系PaWBPs和江西吉安株系PaWBJan的tmk基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明:从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3;PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%;tmk-b基因为单一序列,两株系的tmkb核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。

泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%;而Pa WBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的p ET28a原核表达载体,对Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2 3种蛋白进行了原核表达,经Ni-NTA柱纯化后,利用双酶法进行了胸苷酸激酶催化活性测定,结果表明,Pa WBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性,为85.96±0.74 U·mg-1,而Pa WBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。本文为进一步研究胸苷酸激酶在植原体繁殖过程中的作用机理奠定了基础。

全反式维甲酸增强携单纯疱疹病毒胸苷酸激酶基因的超声微泡对SMMC-7721细胞的旁观者效应

目的观察经全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导后,单纯疱疹病毒胸苷酸激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)对人肝癌细胞SMMC-7721旁观者效应的影响。方法免疫组化法观察经全反式维甲酸诱导前后SMMC-7721细胞连接蛋白Cx32的表达;将含有HSV-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面上,采用超声辐照转染并用倒置显微荧光镜及RT-PCR观察TK基因的转入及表达;MTT法观察经全反式维甲酸诱导后HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应。结果经全反式维甲酸诱导后SMMC-7721细胞膜上Cx32表达明显增加,而胞质内仅少量表达;通过超声辐照后HSV-TK基因可顺利转入SMMC-7721细胞中并稳定表达;与对照组相比,经全反式维甲酸诱导组可明显提高HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应(P<0.05)。结论全反式维甲酸可提高SMMC-7721细胞中连接蛋白Cx32的表达且能正确定位于细胞膜上,这可能与其能增强HSV-TK/GCV系统对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应有关。

从TCMSP中药数据库中筛选猴痘病毒胸苷酸激酶抑制剂

目的:运用虚拟筛选技术从中药数据库中筛选猴痘病毒胸苷酸激酶潜在的中药小分子抑制剂。方法:基于已公布的猴痘病毒胸苷酸激酶序列,利用同源模建技术构建猴痘病毒胸苷酸激酶三维结构,运用基于对接的虚拟筛选技术进行多轮筛选,包括高通量虚拟筛选、标准精度虚拟筛选、高精度虚拟筛选、Prime MMGBSA结合自由能筛选等。结果:筛选出了15个对猴痘病毒胸苷酸激酶具有潜在抑制活性的化合物,并分析了化合物MOL002468,MOL009538,MOL000416,MOL009237与胸苷酸激酶的结合模式,包括氢键、疏水相互作用、共轭和盐桥等受体-配体相互作用。结论:成功构建猴痘病毒胸苷酸激酶的虚拟筛选策略,发掘可用于预防、治疗猴痘病毒的药物,促进传统中药数据库的进一步开发和利用。

大肠杆菌胸苷激酶基因的克隆表达与应用研究

目的:构建含大肠杆菌胸苷激酶基因(tdk)的重组质粒,并对胸苷激酶性质进行研究。方法:通过PCR技术从大肠杆菌K-12中扩增出tdk基因,并克隆到表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌株(DTK)。结果:成功扩增出了tdk基因,并构建了重组菌株。结论:获得的tdk基因长为618bp,重组菌株能表达出大量可溶性胸苷激酶蛋白。胸苷激酶的酶比活力可达到1 600U/mg;酶最适温度为45℃;最适pH为8.0。同时,胸苷激酶最佳反应条件为:50mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,30U的粗酶,5mmol/L的MgCl2,5mmol/L的TR,5mol/L的ATP,45℃反应100min,胸苷酸的转化率可达到60%以上。

HK-Ⅱ、TS和Ki-67在青年人结肠癌组织中的表达及其意义

目的检测己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)、胸苷酸合成酶(TS)和Ki-67核抗原(Ki-67)在青年人结肠癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法采用免疫组织化学法检测78例青年人(≤40岁)结肠癌和75例随机抽取的同期收治的中老年人(>40岁)结肠癌组织中HK-Ⅱ、TS及Ki-67蛋白的表达。结果 HK-Ⅱ和TS在青年人组和中老年人组结肠癌组织中的阳性表达率分别为82.1%(64/78)和65.3%(49/75),69.2%(54/78)和52.0%(39/75),而Ki-67增殖指数分别为(59.1±3.0)%和(48.5±3.2)%。两组比较,以上三种蛋白的表达水平差异均有统计学意义(均P<0.01)。HK-Ⅱ、TS及Ki-67表达在青年人结肠癌肿瘤分化程度、分期之间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。青年人结肠癌HK-Ⅱ表达与TS、Ki-67成正相关性。结论 HK-Ⅱ、TS和Ki-67阳性蛋白表达可作为青年人结肠癌的恶性指标。

13例EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌的临床病理分析

目的探讨棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)-间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的临床病理特征。方法回顾性分析13例EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者的临床病理特征,采用HE染色观察组织病理学特征,免疫组化染色法检测组织胸苷酸合成酶(TS)的表达情况,DNA扩增后直接测序法检测组织表皮生长因子受体(EGFR)及K-Ras的突变情况,并分析该亚型肺癌患者培美曲塞的疗效。结果 13例EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者均为腺癌,男性5例,女性8例,中位年龄48岁,4例有吸烟史。10例NSCLC组织为腺泡样结构,其中6例伴有胞内或胞外黏液;所有患者均未检出EGFR和K-Ras基因突变,3例TS高表达,10例TS低表达;7例曾接受培美曲塞化疗方案,疾病控制率为85.7%,中位疾病进展时间为5.5个月。结论 EML4-ALK融合基因阳性NSCLC多见于不吸烟的年轻女性腺癌患者,多为伴有黏液产生的腺泡样结构,不同时合并EGFR和K-Ras突变,组织中TS低表达,大部分对培美曲塞化疗较敏感。

RV-HSV-TKc/GCV治疗脑胶质瘤效果及其影响因素

目的研究应用逆转录病毒介导中国单纯疱疹病毒TK基因治疗系统(RV-HSV-TKc/GCV)治疗脑胶质瘤的可行性及其影响因素。方法通过体外和大鼠实验,观察转TKc细胞在治疗中的量效关系;转基因方式对疗效的影响;基因治疗细胞在瘤内的分布;治疗动物的肿瘤免疫反应。结果①TKc胶质瘤细胞对GCV的敏感浓度>0.01μg/ml,PLCTKcSN细胞与胶质瘤细胞混合培养120h较混育24h的GCV敏感性高,在GVC有效杀伤范围内,基因治疗细胞与瘤细胞数量比值>1.0;②3种方式的体内治疗结果表明TKc/GCV具有一定抑制肿瘤生长作用;③接种后第5、10、15天的针道周围可见有大量TK表达阳性细胞,距针道5mm处TK阳性细胞则难以见到,与肿瘤交界的正常脑组织无TK阳性细胞;④治疗后长期生存大鼠5只再次接种瘤细胞28d后剖检,2只未见肿瘤生长,3只有肿瘤生长但明显小于对照组;实验组NK活性和ADCC效应高于对照组。结论在治疗细胞数量足够的前提下TKc/GCV基因治疗系统对大鼠脑胶质瘤有控制生长作用;该系统具有一定调节体内主动免疫效能。治疗细胞的基因转导能力,在瘤内的分布局限性,GCV局部浓度和机体的免疫状态是影响该基因治疗效果的主要因素。

MTHFR多态性对晚期胃肠癌患者5-氟尿嘧啶为基础化疗作用的研究

胃肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤,研究表明,化疗可以延长患者的生存期,提高患者的生存质量,因此化疗对晚期胃肠癌患者的治疗有着重要意义。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是治疗胃肠癌最常用的化疗药物之一。5-Fu进入体内后,经胸苷激酶转变成5-氟-2′-脱氧尿苷-5′单磷酸盐（5-Fd UMP）,后者与5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-MTHF）和胸苷酸合成酶（TS）形成稳定的共价络合物,从而干扰DNA的合成和修复。

胃腺癌组织己糖激酶-Ⅱ的表达及临床意义

目的分析胃腺癌组织己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)的表达水平与化疗相关蛋白(胸苷酸合成酶,TS)、细胞增殖、凋亡指数、患者临床病理特征及预后的关系。方法收集62例胃腺癌组织临床标本,采用免疫组织化学法检测胃腺癌HK-Ⅱ和TS的表达,分析HK-Ⅱ的表达与临床病理特征及无疾病生存期(DFS)的关系。用Ki-67标记细胞增殖指数,用TUNEL法检测细胞凋亡,并进行相关的统计学分析。结果胃腺癌HK-Ⅱ和TS阳性表达率分别为71.0%(44/62)和61.3%(38/62),且两者呈正相关关系。胃腺癌组织中HK-Ⅱ的高表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期有关及DFS短有关(P<0.05),但与患者年龄、性别和肿瘤部位无关(P>0.05)。与HK-Ⅱ阴性表达的患者相比,HK-Ⅱ阳性表达的胃腺癌组织增殖指数明显增高,凋亡指数显著降低(P<0.01)。结论胃腺癌组织中HK-Ⅱ的表达上调,其表达水平与肿瘤的分化、淋巴结转移、临床分期及预后有关,可能与化疗敏感性有关。HK-Ⅱ的高表达可能通过促进细胞增殖、诱导细胞凋亡,在胃癌的发生、发展及耐药过程中发挥重要作用。

非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因与TYMS mRNA表达的关系

目的探讨非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)组织中棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因与胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TYMS)mRNA表达的关系。方法应用实时荧光定量PCR方法检测257例NSCLC组织中EML4-ALK融合基因、TYMS mRNA的表达。结果非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因阳性率占4.28%(11/257),在不吸烟患者中较高(P<0.05);TYMS mRNA高表达占63.42%(163/257)。与未检测到EML4-ALK融合基因阳性的非小细胞肺癌患者比较,EML4-ALK融合基因阳性与TYMS mRNA表达水平相关(P<0.05)。结论非小细胞肺癌组织中EML4-ALK融合基因阳性患者TYMS倾向低表达,可能从一线化疗药的培美曲塞中受益。

TS、ERCC1和DNA-PKcs在大肠癌组织中的表达及临床意义

[目的]探讨TS、ERCC1和DNA-PKcs在大肠癌组织中的表达及其临床意义。[方法]将133例大肠癌标本与17例正常大肠组织标本构建成组织芯片,应用免疫组化SP法检测TS、ERCC1和DNA-PKcs在大肠癌芯片中的表达,并分析其与大肠癌临床病理特征的关系。[结果]TS在大肠癌组织中的表达显著高于正常大肠组织(P<0.05),而ERCC1、DNA-PKcs在大肠癌组织中的表达与正常大肠组织无明显差异(P>0.05)。TS、ERCC1和DNA-PKcs的表达均与淋巴结转移和Dukes分期有关(P<0.05)。ERCC1和DNA-PKcs、TS和ERCC1表达间均呈明显正相关(P<0.01)。[结论]检测TS、ERCC1和DNA-PKcs在大肠癌中的表达对预测大肠癌的发生、发展有一定意义。

子宫内膜癌患者血清检测VEGF与TK1的临床应用

目的测定子宫内膜癌患者血管内皮生长因子（VEGF）、胸苷酸激酶（TKl）的水平，探讨二者在子宫内膜癌患者血清的浓度水平。方法选取2007年6月至2012年5月在枣庄市立医院妇科住院的子宫内膜癌患者（经病理证实）共86例，按国际妇产科联盟（FIGO）2006年的标准进行手术病理分期及病理分级。正常对照组31例，为女性健康查体者，排除合并肿瘤及其他感染性疾病等。结果31例健康对照组血清中VEGF和TKl水平分别为（884-32）pg／ml和（2．94-1．3）pmol／L，而86例子宫内膜癌患者血清的VEGF和TKl水平为（8094-214）pg／ml和（8．04-2．3）pmol／L，明显高于健康对照组（P〈0．01）。且二者的血清浓度与患者的病理分期呈正相关。结论血VEGF和TK1的水平与子宫内膜癌患者有密切的关系，可作为其发生、发展和预后的判定指标。在子宫内膜癌生长过程中，随着TK1表达量由低到高，VEGF促进肿瘤细胞生长的作用增强。把这两种指标与临床指标进行分析，可作为子宫内膜癌患者的早期诊断以及判断术后预后提供相关的理论基础和依据。