豁痰祛瘀法抗脂凋亡的研究进展

脂凋亡与代谢综合征密切相关,可能是其原发病理生理基础。祖国医学认为痰、瘀是脂凋亡相关疾病的主要致病因素,采用豁痰祛瘀法治疗脂凋亡相关疾病有很好的疗效。本文就豁痰祛瘀法抗脂凋亡部分机制作简要综述。

豁痰祛瘀法抗脂凋亡的研究进展

非脂肪细胞脂类超负荷，对细胞功能及生存发育造成毒副影响。脂凋亡指在前述基础上通过神经酰胺、NO等启动凋亡基因，引发脂肪源性凋亡级联反应，其在非酒精性脂肪性肝炎、冠心病、2型糖尿病等代谢相关疾病的发生、发展及其预后起了至关重要的作用。

脂毒性脂凋亡与酒精性脂肪性肝病

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为酒精性脂肪肝，进而可发展成酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至导致肝功能衰竭[1-2]。现介绍肝细胞内脂质沉积介导的脂毒性脂凋亡在酒精性脂肪性肝病（alcoholic fatty liver disuse，AFLD）发病机制中的作用。

平糖方药物血清改善INS-1胰腺β细胞脂性凋亡的作用研究

目的观察平糖方药物血清对INS-1胰腺β细胞脂性凋亡的改善作用及机制。方法以软脂酸(palmitic acid,PA)诱导INS-1胰腺β细胞脂性凋亡,采用平糖方药物血清干预。实验分为5组,即大鼠血清对照(RS)组、大鼠血清加PA(PA)组、平糖方低剂量药物血清加PA(PTR L)组、平糖方中剂量药物血清加PA(PTR M)组、平糖方高剂量药物血清加PA(PTR H)组,每组6个复孔。通过TUNEL法检测细胞凋亡,化学发光法检测Caspase-3活性,DCHF-DA掺入法检测细胞内ROS生成的变化,RT-PCR方法检测解偶联蛋白-2(UCP-2)的表达。结果 PA组比RS组的凋亡细胞增多(P<0.01),PTR各组的凋亡细胞同PA组比较有降低的趋势。PA组INS-1胰腺β细胞Caspase-3酶活性增强,PTR M组同PA组比较Caspase-3酶活性降低(P<0.05)。PTR L、M组可抑制由PA引起的细胞内ROS产生增多,与PA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。平糖方各组的UCP-2 mRNA表达量均较PA组降低(其中PTR L 1.286±0.373,P<0.01;PTRM 1.627±0.348,P<0.05)。结论平糖方药物血清对INS-1β细胞脂性凋亡有一定的保护作用,并可能通过调节ROS、UCP-2发挥作用。

JNK/c-Jun信号通路对非酒精性脂肪性肝炎脂性凋亡的影响

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病的一个重要病理阶段,其可以发展为肝硬化,甚至肝细胞癌,对疾病的进展起决定性作用。对NASH发生、发展机制的研究普遍接受"二次打击"学说。其中,肝细胞脂毒性凋亡是NASH的一个重要病理组织学特征。c-Jun氨基端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员。JNK/应激活化蛋白激酶应激信号通路与NASH的发病机制密切相关,在NASH中多种应激刺激都能激活肝脏内的JNK信号通路,诱导细胞凋亡。

长期接触高浓度游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响

目的研究高浓度游离脂肪酸(FFA)对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响。方法将胰岛β细胞长期的暴露在高浓度的游离脂肪酸(2 mmol/L,油酸/软脂酸2∶1)下,观察胰岛β细胞的凋亡情况。主要通过2种方法来评价凋亡的情况:①膜联蛋白V标记偶联异硫氰酸荧光素(annexin-V FITC)和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色;②酶联免疫吸附测定法(ELISA)来定量细胞质中的DNA片段。结果在高浓度的游离脂肪酸的持续培养下:①培养5 d之后,被annexin-V FITC和PI双染的细胞数量明显增多。在第7天,高浓度FFA接触组的凋亡细胞数量与对照组的差异显著,为18.8%±4%与5.6%±2%(,n=5;P<0.001)。②PI确定的坏死细胞的数量在两组中没有差异,高FFA组与对照组分别为4.8%±0.3%和4.5%±0.5%。③通过对培养的细胞进行酶标记免疫吸附测定法,得到高FFA组的凋亡细胞要明显多于对照组(1.97±0.6与0.49±0.1,n=5;P<0.001)。结论长期接触高浓度游离脂肪酸处理过的细胞,与对照组相比,会有较多的细胞凋亡和DNA片段。长期接触高浓度游离脂肪酸会造成胰岛β细胞脂性凋亡,因此可推测在2型糖尿病患者体内经常会出现的β细胞功能的丧失与体内的高FFA有关,可能涉及到氧化应激方面的机制。

JNK信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮的干预作用

目的:探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮(PGZ)的干预作用.方法:采用游离脂肪酸(FFA)诱导小鼠βTc3细胞凋亡;以MTT法观察FFA对细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学和Western Blot法检测在FFA、特异性JNK抑制剂SP600125及PGZ作用下磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化c-jun(p-c-jun)的表达.结果:FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,JNK阻断剂及PGZ可显著减少这一过程引起的凋亡;且FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着JNK信号通路中p-JNK和p-c-jun的升高;用SP600125预处理细胞后,可明显减少p-JNK和p-c-jun的活化;而PGZ未能抑制FFA引起的JNK活化.结论:JNK信号通路参与了FFA诱导的小鼠βTc3细胞凋亡;PGZ可明显抑制胰岛βTc3细胞凋亡,但这一过程可能没有通过JNK信号通路.

氧化型极低密度脂蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡

探讨氧化型极低密度脂蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的作用。应用低温超速离心法分离健康人血浆极低密度脂蛋白 ,用CuCl2氧化得到氧化型极低密度脂蛋白。琼脂糖凝胶电泳观察巨噬细胞凋亡DNA断裂“梯状”图谱 ;流式细胞仪和二苯胺法分别测定凋亡巨噬细胞百分率和DNA片断百分率 ;光镜观察凋亡巨噬细胞形态变化。结果发现 :①氧化型极低密度脂蛋白能诱导巨噬细胞发生凋亡及DNA断裂 ;②抗氧化剂二甲基硫脲能部分抑制氧化型极低密度脂蛋白诱导的DNA断裂 ;③核转录因子核因子κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐可完全抑制氧化型极低密度脂蛋白诱导的DNA断裂。提示氧化型极低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡可能是动脉粥样硬化形成机制之一 ;氧化型极低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的作用可能与自由基和激活核因子κB有关。

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时泛素缀合酶和p53的表达

为研究氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡时泛素—蛋白酶体通路中泛素缀合酶、p5 3与泡沫细胞凋亡之间的关系 ,用氧化型低密度脂蛋白处理人单核细胞U937细胞 ,诱导其凋亡 ,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡 ,逆转录聚合酶链反应检测泛素缀合酶和p5 3的基因表达 ;流式细胞术分析泛素缀合酶、载脂蛋白B和P5 3的蛋白表达。结果发现 ,氧化型低密度脂蛋白可以诱导U937细胞凋亡 ,在U937细胞凋亡过程中泛素缀合酶表达降低 ,p5 3表达增高 ,而且细胞内载脂蛋白B也增加。结果提示 ,泛素缀合酶的表达降低可能使P5 3和载脂蛋白B经泛素—蛋白酶体通路的降解减慢 ,从而引起P5 3和载脂蛋白B在细胞内积聚 。

蛋白磷酸酶4显性负性突变体介导的活性抑制改善棕榈酸诱导的肝细胞脂性凋亡

目的探讨抑制蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4,PP4)活性对肝细胞脂性凋亡的影响。方法以400μmol/L的棕榈酸(palmitic acid,PA)处理HepG2细胞24 h建立肝细胞脂性凋亡模型;以西方饮食喂养C57BL/6J小鼠16w建立非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)模型;构建磷酸酶活性缺失的显性负性突变体AD-PP4RL腺病毒载体;转染AD-PP4RL至HepG2细胞腺病毒以抑制肝细胞中PP4的活性;尾静脉注射AD-PP4RL以抑制肝脏中PP4的活性;转染RAC1慢病毒至HepG2细胞中抑制RAC1的表达;BoDIPY染色检测细胞及组织中脂质蓄积情况;TUNEL染色检测细胞凋亡水平;免疫沉淀结合丝苏氨基酸磷酸酶活性检测法测定PP4活力;GTP酶活性检测试剂盒检测RAC1活性;Western印迹检测脂质代谢及脂性凋亡相关蛋白的表达水平。结果①在PA处理的HepG2细胞及西方饮食喂养诱导的NASH小鼠肝脏中PP4活性升高;②过表达磷酸酶活性缺失突变的腺病毒载体AD-PP4RL能有效抑制PP4活性;③抑制PP4活性降低PA诱导的HepG2细胞及NASH小鼠肝脏中脂性凋亡水平,下调脂性凋亡相关基因PUMA、Bim及c-caspase3的水平;④RAC1介导了在PP4在肝细胞脂性凋亡中的作用。结论抑制PP4活性可以通过抑制RAC1介导的JNK信号通路的激活,改善肝细胞脂性凋亡。

研究细胞凋亡的新模式生物——酵母

细胞凋亡是受到严格调控的细胞自杀过程,凋亡机制从酵母到动物细胞高度保守.酵母细胞的凋亡过程虽发现较晚,但研究进展迅速.多个证据表明,酵母确实能发生细胞凋亡且细胞凋亡机制具有较高的保守性.酵母已成功用于发现新的细胞凋亡因子.近来,酵母还用作亨丁顿舞蹈症、帕金森氏病等凋亡相关疾病的细胞模型,为治愈这些疾病提供思路和指导.综述了酵母作为凋亡研究模式生物的可行性和独特的优势,其应用前景、存在的瓶颈问题及可能的解决方案.利用酵母为模式生物研究细胞凋亡和疾病发生,将大大加快发现新凋亡因子的过程,同时酵母作为凋亡相关疾病模式生物具有广阔的发展空间.

慈菇消脂丸含药血清对HepG2细胞脂性凋亡的影响

目的探讨慈菇消脂丸含药血清对游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂性凋亡的影响。方法SD大鼠给予慈菇消脂丸药液(2 mL/100 g)灌胃以提取并配制不同浓度含药血清;以500μmol/L游离脂肪酸诱导HepG2细胞构建模型,随机分为空白对照组、模型组(500μmol/L FFA)、慈菇消脂丸含药血清低剂量组(500μmol/L FFA+2%含药血清),慈菇消脂丸含药血清高剂量组(500μmol/L FFA+6%含药血清),JNK抑制剂组(500μmol/L FFA+20μmol/L SP600125),诱导培养24 h,电镜观察细胞超微结构,荧光染色观察caspase⁃8、Fas⁃L、p⁃JNK,试剂盒检测SOD、MDA、ALT、AST。结果空白对照组细胞内未见脂滴,模型组出现脂滴,其余各组脂滴减少。与空白对照组比较,模型组caspase⁃8、Fas⁃L、p⁃JNK表达增高(P<0.01),细胞培养液ALT、AST、MDA水平增高及SOD水平降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,慈菇消脂丸含药血清各剂量组caspase⁃8、Fas⁃L表达降低(P<0.01),慈菇消脂丸含药血清高剂量组ALT、AST、MDA水平降低及SOD水平升高(P<0.05,P<0.01)。结论慈菇消脂丸含药血清对游离脂肪酸诱导的HepG2脂性凋亡有干预作用,可能与凋亡蛋白caspase⁃8、Fas⁃L相关。

β细胞脂性凋亡与2型糖尿病

2型糖尿病是随着肥胖人群的增多而发病增加的疾病，其发生是胰腺β细胞分泌的胰岛素不足以代偿胰岛素抵抗的结果。肥胖者脂肪组织分解产生的游离脂肪酸（FFA）明显增加，不仅参与胰岛素抵抗的发生，也证实有着损害β细胞功能，导致β细胞凋亡的作用。β细胞脂性凋亡学说近年来逐渐成为人们关注、研究的热点。了解2型糖尿病胰岛β细胞脂性凋亡的机制，对深入认识糖尿病的发病机制和致病过程，更好地防治2型糖尿病具有重要意义。

翻白草水提液对大鼠胰岛细胞脂毒性损伤的保护作用

目的探讨翻白草水提液对大鼠胰岛细胞脂毒性损伤的影响。方法棕榈酸诱导Wistar大鼠原代胰岛细胞凋亡模型后,FDA/PI双染和流式法检测细胞凋亡,ELISA法测定GSIS水平,qPCR检测FAS、CPT-1 mRNA表达,Western blot检测AMPK蛋白表达,硫代巴比妥酸法测定细胞内丙二醛(MDA)活性,分光光度计法测定细胞还原型谷胱甘肽(GSH)活性。结果与对照组比较,棕榈酸组GSH活性、CPT-1 mRNA表达、p-AMPK蛋白表达显著降低,MDA含量、FAS mRNA表达显著增加(P<0.05),而翻白草水提液+棕榈酸能明显逆转棕榈酸组上述作用。与翻白草水提液+棕榈酸组比较,BML-275(AMPK选择性抑制剂)组GSH活性、CPT-1 mRNA表达显著降低,MDA活性、FAS mRNA表达显著增加(P<0.05)。结论翻白草水提液可能通过激活AMPK,抑制脂肪酸合成,促进脂肪酸β氧化,从而抑制氧化应激所致胰岛细胞脂性凋亡,最终改善胰岛素分泌功能。

肾气丸对非酒精性脂肪性肝炎大鼠Bcl-2/Bax、Fas/FasL信号通路的影响

目的:观察Bcl-2/Bax、Fas/Fas L介导的信号转导通路在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠的作用及肾气丸对其的影响。方法:采用高脂饲料连续喂养12周建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型,同时以肾气丸进行干预12周。HE染色观察大鼠肝组织病理组织学变化,免疫组织化学检测肝组织中Fas、Fas L、Bcl-2、Bax、Caspase-8蛋白的表达;Realtime-PCR法检测肝组织Caspase-8 mRNA表达。结果:模型组大鼠肝组织Bcl-2、Bax、Fas、Fas L蛋白以及Caspase-8 mRNA和蛋白表达均较正常组显著增加(P<0.01),Bcl-2/Bax比值较正常组明显的降低(P<0.05);大鼠肝组织Caspase-8蛋白表达与Fas、Fas L蛋白表达均呈明显正相关(r分别为0.907、0.804,P均<0.01);予以肾气丸干预后,Bax、Fas、Fas L蛋白的表达以及Caspase-8 mRNA和蛋白的表达均较模型组明显的降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值较模型组明显的增加(P<0.05),Bcl-2蛋白的表达与模型组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:肾气丸可能通过影响Bcl-2/Bax、Fas/Fas L信号转导通路,下调Bax、Fas、Fas L、Caspase-8表达,减少肝细胞的脂性凋亡,从而防治大鼠非酒精性脂肪性肝炎的发生发展。

二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用

目的探讨二甲双胍(MF)在游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛细胞凋亡中的作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察FFA对小鼠βTc3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞的凋亡率;免疫细胞化学和Western blot法检测p-JNK、p-c-jun在FFA、特异性JNK抑制剂(SP600125)阻断JNK信号转导通路情况下及MF作用下的表达。结果FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显的抑制作用,并可诱导细胞凋亡;MF可显著减少这一过程中的细胞凋亡。细胞免疫化学及Western blot结果显示,FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着p-JNK和p-c-jun的升高而增加;用SP600125预处理βTc3细胞后,可以明显减少p-JNK和p-c-jun的活化,而MF没有能够抑制FFA引起的p-JNK活化。结论MF可以抑制FFA介导的小鼠βTc3细胞凋亡,但不是通过JNK信号转导通路发挥作用的。

帕金森病理机制常谈常新:多巴胺能神经的氧化性死亡--ferroptosis和oxytosis

黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和多巴胺神经递质的释放减少,是临床上导致帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理机制。在基因和环境的共同影响下,存在多种多巴胺能神经元的死亡机制。目前的研究认为凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)和自噬性死亡(autophagic death)都参与了多巴胺能神经元的死亡,但是这些死亡方式还不足以解释其病理进程和机制。铁死亡(ferroptosis)是一种新近发现的铁依赖性程序性细胞死亡途径,其主要特征为铁离子的负荷增多和大量脂质过氧化物的堆积,这些特征与临床上PD病人的大脑分子生物学特征高度吻合。此外,有证据显示ferroptosis和三十年前在神经细胞中发现的氧化凋亡(oxytosis)死亡途径在信号调节等方面具有高度相似性,它们都由氧化应激诱导,可能代表着同种形式的程序性细胞死亡。本综述讨论了目前ferroptosis死亡途径在PD中的研究进展,并简述了关于ferroptosis和oxytosis作为同种细胞死亡方式的可能性。阐明多巴胺能神经元死亡方式及其机制可为抗PD药物的研发提供重要的理论依据。

微小RNA-375调控NIT-1胰岛细胞脂性凋亡

目的 探讨提高或降低内源性微小RNA-375(miRNA-375)的水平是否影响小鼠胰岛β细胞NIT-1的脂性凋亡.方法 以500μmol/L长链不饱和游离脂肪酸棕榈酸孵育NIT-1 48 h,建立脂性凋亡模型,并以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测重组胰岛素样生长因子1(V1)表达水平.将NIT-1分为:空白组(正常培养细胞),空转组(等量lipo 2000),阴性对照miRNA组(等量lipo 2000+阴性对照miRNA),miRNA-375组(等量lipo 2000+miRNA-375)(提高内源性miRNA-375水平),2'-O-me-375组(等量lipo 2000+2'-O-me-375)(降低内源性miRNA-375水平).在2 ml转染体系,通过转染脂质体lipo 2000 5 μl(空白组不加),以80 nmol/L miRNA或对照物(空转组不加)转染NIT-1,72 h后各组分别予500μmoL/L棕榈酸孵育48 h.72 h后各组分别予500μmol/L棕榈酸孵育48 h.以Hochest 33342染色和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测并计算凋亡率,以Western blot检测V1表达水平.结果 棕榈酸组凋亡细胞数明显比对照组增多,而V1表达水平比对照组下降约66.8%(t=5.051,P＜0.0001).与其他三组比较,miRNA-375组脂性凋亡率最高,比空白组升高73.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高1.47倍(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001).miRNA-375组V1表达水平降低,比阴性对照miRNA组降低56.06%(P＜0.05).而另一方面,与其他三组比较,2'-O-me-375组脂性凋亡率最低,比空白组降低64.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组下降49.6%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P=0.001).2'-O-me-375组V1表达水平最高,比空白组升高5.33倍(P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高75.9%(P=0.021).结论 棕榈酸诱导小鼠胰岛细胞凋亡伴有V1表达水平下降;miRNA-375参与调节小鼠胰岛β细胞的脂性凋亡.