脂多糖应答基因对神经元细胞类缺血再灌注损伤的影响

目的研究神经元细胞中脂多糖应答基因(LRG)的表达对细胞类缺血再灌注损伤的影响。方法将小鼠神经元细胞分为对照组和处理组,处理组给予体外类缺血再灌注处理,采用定量PCR(qPCR)和Western blot的方法检测细胞中LRG基因的表达。将原代培养的神经元细胞分为空白组、空载质粒组、过表达组、非特异小干扰RNA(siRNA)组、沉默组,过表达组/沉默组转染LRG基因过表达质粒或siRNA,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞经类缺血再灌注后的生长状况,同时利用Western blot分析细胞中活化蛋白激酶B(pAkt)的表达。将原代培养的神经元细胞再分为阴性对照组、过表达组和抑制剂组,抑制剂组利用20μmol/L LY294002抑制细胞中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的正常功能,MTT法分析过表达LRG基因的细胞体外生长状况,同时利用Western blot方法分析细胞中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3的表达。结果与对照组相比,类缺血再灌注处理显著降低细胞中LRG基因的表达(P<0.05)。过表达LRG基因可显著提高缺血再灌注损伤细胞在体外的存活(P<0.05),而沉默LRG基因则降低细胞的存活(P<0.05)。同时,过表达LRG基因上调细胞中pAkt的表达而沉默LRG基因则下调pAkt的表达(P<0.05)。抑制神经元细胞中PI3K可降低缺血再灌注损伤后细胞的存活率(P<0.05),并且提高细胞中活化caspase 3的表达(P<0.05)。结论在神经元细胞中过表达LRG能通过激活PI3K/Akt信号途径降低细胞在类缺血再灌注中的损伤。

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠandXhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3.1载体中;pcDNA3.1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP-c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功。说明:成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His/mlrpS融合蛋白。

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体(lrpΔC)和突变体(lrpm)序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-lrp、pcDNA3.1(+)-lrpΔC和pcDNA3.1(+)-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示:人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3.1(+)。

TNF-α对人lrg基因表达的调控

目的:观察TNF-α对脂多糖应答基因(lrg)在人HEK293和U937细胞中表达的影响.方法:正常培养人胚肾细胞(HEK293)和人单核细胞(U937),用TNF-α(终浓度1×106U/L)刺激2h.提取刺激前后HEK293和U937细胞的总蛋白,用纯化后的兔抗人Lrg抗血清作一抗(1∶1000),对TNF-α刺激前后的HEK293和U937细胞进行Western Blot分析.提取刺激前后HEK293和U937细胞的总RNA,用RT-PCR分析TNF-α对lrg在细胞中表达的影响.以β-actin为内参.结果:Western Blot分析显示,用TNF-α刺激2h后,lrg在人HEK293和U937细胞内的蛋白含量明显上升;RT-PCR结果显示,用TNF-α刺激2h后,人HEK293和U937细胞内的lrg mRNA水平明显上升.结论:TNF-α的刺激增强了人HEK293和U937细胞内lrg的表达,提示lrg可能参与了TNF-α诱导的炎症反应.

人Lrp蛋白在细胞中的定位及LPS对其表达的影响

为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western印迹表明,吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合,并有较高免疫印迹滴度,为Lrp功能研究提供了重要的工具.激光共聚焦扫描荧光显微镜检测显示Lrp主要位于细胞核膜周围.Western印迹、RT-PCR以及细胞免疫组化染色结果都表明,用LPS刺激后,lrp在人HEK293和U937细胞内的表达均有明显的上升.结果提示,Lrp可能与对Lrp介导的反应有关.

人Lrp蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备人Lrp蛋白多克隆抗体.方法:克隆全长lrp-cDNA编码序列并进行原核表达与鉴定.用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白,获得纯度较高的目的蛋白.用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.结果:Western印迹结果表明,纯化前后的抗血清在69ku处均检测到目的蛋白条带,说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合.而纯化后抗体Western印迹结果目的条带只有一条,说明吸附纯化后得到高特异性抗血清,其免疫印迹的效价在10-6以上,有较高免疫印迹滴度.结论:成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体,为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.