改良热酚水法制备大肠杆菌O157:H7脂多糖抗原的研究

采用热酚水法提取肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的脂多糖(LPS),经浓缩酶解,离心分离得纯化LPS,酸解制得O-特异性侧链(O-PS),能有效去除核酸及杂蛋白,抗原具有鲎试剂凝集活性及对产蛋鸡有较强的免疫原性,建立了一种改良热酚水法提取制备O157:H7特异性脂多糖抗原的方法。

牛布氏杆菌病热酚法脂多糖抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)的研究

采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的热酚法提取的脂多糖(LPS)作为抗原,建立了牛布氏杆菌病的ELISA方法,对45份血清进行检测,证明本ELISA方法灵敏性较高,经阻断试验和交叉试验,证明特异性较好。同时对建立的ELISA方法进行了改进,使制备的牛布氏杆菌ELISA试验试剂盒能在4℃条件下长期保存,具有良好的稳定性和重复性。

布鲁氏菌脂多糖抗原结构的研究进展

布鲁氏菌脂多糖在布病的发病机理及免疫学诊断中具重要意义。近年来的有关研究进展较快。现仅就其抗原结构的研究现状作以概述。自从Miles及Piries最早报导布鲁氏菌的A和M抗原决定簇表现在一个单一的复合物分子上(一种含有甲酰基残基的氨基多羟基组成物,也称AP物质)后,布鲁氏抗原结构的分析才陆续有报导。但研究进展不快。1969年Ahvonen等人观察到Brucell、abortus(牛种布鲁氏菌)和Yersinia enterocolitica Serotype O:P(结肠炎耶尔森氏菌O:9血清型、简称Ye 0:9)

河北省A群脑膜炎奈瑟氏菌脂多糖抗原血清型分布及流行病学意义的研究

1985年收集全省8地市 A 群 NM 菌153株进行 LPS 分型,证明 L10型分布广,病例数最多,人群带菌率也高,易引起播散,可能是我省流脑暴发流行的主要菌型。菌的型别似与病情轻重无关。

脂多糖抗原诊断钩端螺旋体病相关性葡萄膜炎

钩端螺旋体(简称钩体)病是一种广泛流行的动物源性疾病，尽管目前已有多种商业试剂盒用于诊断系统性钩体病，但试剂盒中起作用的具体抗原的性质仍不清楚。钩体病相关性葡萄膜炎是系统性钩体病的一种晚期并发症，该研究目的在于验证并评估钩体脂多糖(LPS)抗原作为钩体病相关性葡萄膜炎的临床辅助诊断的意义。

奇异变形杆菌脂多糖抗原的制备及其对小鼠免疫原性、毒性、安全性和保护性评价

目的筛选耐受抗生素种类多、毒力强、免疫原性好、安全性高及副反应小的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM),为预防用疫苗的生产提供生产用菌株。方法选择31株PM,通过检测抗生素耐药性、毒力,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)抗原的免疫原性、安全性及毒性筛选候选菌株,进一步评价其多价抗原对候选株的保护性和同种属其他菌株的交叉保护性。结果大部分PM具有多重耐药性,对四环素、氯霉素的耐药性分别为83.87%和87.09%,但对亚胺培南、头孢噻肟敏感,仅为3.23%和29.03%,其中耐受4种以上抗生素的占57%。筛选出9株毒力较强的候选菌株。盐酸羟胺在位消化最佳时间在66~72 h之间,LPS抗原含量达到稳定,为1.150 mg/mL。候选株LPS抗原的免疫原性均低于10μg/mL;安全性符合要求;毒性试验LD50除PM15(0.379 mg/mL)、PM100(0.594 mg/mL)和PM109(0.424 mg/mL)外,其余菌株均不低于0.6 mg/mL;Dienes试验表明,6株PM均属于不同菌株。LPS多价抗原对候选株的保护率达70%以上,对PM其他菌株的交叉免疫保护率分布在20%~90%之间,50%以上的占77.78%。结论6株PM候选株LPS多价抗原对候选株具有保护性,也对PM其他菌株具有交叉保护性,为后续PM医院获得性感染的预防研究提供了数据支持。

结核菌脂多糖和酚提取蛋白在临床血清诊断中的应用

以结核菌脂多糖和酚提取蛋白为抗原，用ELISA方法对肺结核痰菌阳性患者、肺癌和老慢支患者、多菌型麻风患者和正常人进行了IgG抗体检测。抗脂多糖抗体和抗酚提取蛋白抗体测试的敏感度都是74．7％，特异性分别为97％和95％。两种测试的相关系数r=0．557。两者并联测定敏感度为85．3％，特异性为94％。如果将阳性判断标准设为两种测试全为阳性，或其中一项强阳性，则敏感度为72．6％，特异性达99％。因此，采用两种抗原作结核病血清诊断，能提高敏感度和特异性。

稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体细胞株的筛选与应用

研制抗羊种布鲁菌脂多糖抗原的单克隆抗体,并应用其建立检测布病的双夹心ELISA方法。本研究采用热酚水法提纯羊种布鲁菌(16M菌株)的脂多糖抗原,并经SDS-PAGE鉴定。用脂多糖和灭活的羊种布鲁菌16M作为免疫抗原,交替免疫6～8周龄BALB/c雌鼠,第1次免疫用羊种布鲁菌标准菌16M全菌加等量弗氏完全佐剂;第2次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐剂。将脂多糖作为包被抗原建立间接ELISA方法,筛选针对抗羊种布鲁菌(16M菌株)脂多糖的单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选出3株能稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5H3、6B8和3H7,细胞培养上清的ELISA效价在1∶1 000～1∶5 000,小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价在1∶10 000～1∶160 000;抗体亚类鉴定表明:5H3、6B8属于IgM亚类,3H7属于IgG3亚类;特异性试验结果显示:3株杂交瘤细胞分泌的抗体不与大肠杆菌O157裂解抗原、鸡白痢沙门氏菌裂解抗原、鸭源鸡杆菌脂多糖抗原以及福氏志贺菌裂解抗原反应,仅与灭活的羊种布鲁菌(16M)发生反应。布鲁菌虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测结果显示,获得的单抗可与标准检测抗原形成明显的颗粒凝集物和伞状凝集物。利用所建立的单克隆抗体细胞株,建立了一种检测布鲁菌的双夹心间接ELISA方法,并进行了特异性和敏感性检测。对模拟样品和临床样品进行检测,准确性均很高。

霍乱CT-B和LPS-O双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒素B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GM1-ELISA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱CT-B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的O抗原,它的脂多糖O抗原通过SDS-PAGE电泳分析,显示它表达了霍乱LPS的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明,有良好的保护作用,因此1046(pMG305)可望成为霍乱活疫苗的候选株。

牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡的研制

为研制一种快速检测牛布鲁氏菌抗体的便捷试纸卡,采用间接荧光免疫层析技术,以荧光微球为标记物,与兔抗牛IgG偶联,以布鲁氏菌脂多糖(LPS)抗原包被硝酸纤维素膜,通过反应条件优化,研制牛布鲁氏菌抗体荧光微球快速检测试纸卡。结果显示:该试纸卡灵敏度可达0.8 IU/mL,与牛口蹄疫病毒O型、牛口蹄疫病毒A型、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的抗体阳性血清均无交叉反应;对469份临床牛血清进行检测,同时与荧光偏振方法进行比较,发现两种方法的符合率为100%。结果表明,本次研制的牛布鲁氏菌抗体荧光微球检测试纸卡灵敏度高,特异性好,适用于临床样品的快速检测。本试纸卡的成功研制为牛布鲁氏菌病免疫效果评估和准确诊断提供了一种简便的血清学诊断方法。

实验性酒精性肝病时脂多糖结合蛋白和脂多糖受体CD_(14)的表达

目的 观察大鼠酒精性肝病时脂多糖结台蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)和脂多糖受体CD_(14)的表达及其在酒精性肝损害中的作用。方法 随机将Wistar大鼠分为乙醇喂养组和葡萄糖喂养对照组,分别在饮水中加入乙醇(剂量5~12g·kg^(-l)·d^(-1))和相同量的葡萄糖。两组大鼠分别于4周和8周测定其血浆中内毒素(LPS)浓度及血清中ALT变化,同时用RT-PCR测定肝组织中LBP和CD_(14) mRNA的表达,并在光镜和电镜下观察肝脏的形态学改变。结果 乙醇喂养组4周和8周时大鼠血浆LPS浓度分别为(129±21)pg/ml和(187±35)pg/ml,明显高于对照组的(48±9)pg/ml和(53±11)pg/ml(t值分别为11.2和11.6. P＜0.05); 乙醇组大鼠血清ALT浓度为(112±15)U/L 和(147±22)U/L,也明显高于对照组的(31±12)U/L和(33±9)U/L(t值分别为5.9和20.6. P＜0.05)。乙醇组大鼠肝组织中LBP和CD_(14) mRNA的表达水平明显高于对照组(P＜0.05),其肝组织发生显著的病理变化,主要表现为脂肪变性、炎性细胞浸润及细胞坏死。对照组肝组织中LBP和CD_(14) mRNA无明显表达,其病理变化也不明显。结论 乙醇能诱导大鼠血中LPS浓度升高和肝组织中LBP与CD_(14) mRNA的表达显著增强、增高的LBP和CD_(14) mRNA能增加肝脏对LPS的敏感性,可能造成肝脏损害。

斑点金免疫渗滤试验检测人沙门菌血清抗体

提纯了鼠伤寒沙门菌（Ｂ群）和肠炎沙门菌（Ｄ群）的脂多糖抗原，混合后用于斑点金免疫渗滤试验，以检测人沙门菌血清抗体。本方法主要针对Ｂ群和Ｄ群沙门菌（约占人类沙门菌感染的７０％），检测其抗体，同时也能检测针对其他各群沙门菌的部分抗体。在肥达试验阳性的血清标本１０６例中，本法的阳性率为９３．４％（９９／１０６）。经培养确认为沙门菌感染的病人血清１８例，本法均显示阳性；经抗生素治疗后血培养阴性８例，但临床诊断为沙门菌感染的病人血清，本法也均显示阳性。在正常人血清标本８２例中，本法的阴性率为９７．６％（８０／８２）。

免疫实验课中ELISA方法的改进

ELISA技术是免疫实验课中一个重要内容。以往用羊抗人IgG诊断血清包被酶标反应板,在操作的最后一步,加入酶底物后,产生的颜色反应区别不明显,影响了试验的敏感性。一般认为影响ELISA试验的因素是多方面的,而抗体包被则是一个重要因素。抗体(IgG)对聚苯乙烯酶标板的吸附能力低于蛋白质多糖抗原,封闭过程更增加了包被IgG的解吸附,从而降低了敏感性。针对这一问题,我们提取了伤寒杆菌“○”的脂多糖作为抗原,用脂多糖抗原包被酶标反应板作ELISA试验,取得了良好的效果,现报道如下。

基于脂多糖的幽门螺杆菌疫苗

加拿大Guleph大学的研究人员证实，脂多糖抗原可在小鼠体内诱生抗幽门螺杆菌（Hp）抗体。 Hp为革兰阴性杆菌，能引起胃炎、消化道溃疡，并已证实是导致胃腺癌的危险因素。目前将抗生素疗法作为Hp的治疗方法，但Guleph大学的研究人员认为，疫苗应是控制Hp传播的最有效方法。

应用间接酶免疫试验检测乳中流产布氏杆菌抗体

加拿大Nielsen等（1996）建立了间接酶免疫试验检测牛乳中流产布氏杆菌抗体,样本来自无布氏杆菌病的加拿大6238份、阿根廷和智利布氏杆菌感染乳牛202份,所有乳样均经聚苯乙烯基质灭活。本试验用脂多糖抗原,辣根过氧化物酶标记的特异性牛IgG1表位的鼠单克隆抗体为抗体。结果发现本试验以智利感染畜群95％样本为参考,其敏感性为95.2±3.7％。

内毒素上调肝细胞表达CD14基因和蛋白的实验研究

目的 观察内毒素血症时肝组织和游离肝细胞中ＣＤ１４基因和ＣＤ１４蛋白的表达。方法 经尾静脉注入脂多糖（ＬＰＳ， Ｅ ｃｏｌｉ Ｏ１１１．Ｂ４）建立大鼠急性内毒素血症动物模型，并用原位胶原酶灌注法分离肝细胞。用流式细胞仪（ＦＣＭ）测定异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）－ＣＤ１４阳性肝细胞数及其荧光强度。同时用逆转录－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定肝组织和肝细胞中ＣＤ１４ｍＲＮＡ和ＣＤ１４蛋白的表达。结果 ＦＣＭ显示：内毒素血症大鼠６ｈ和１２ｈＦＩＴＣ－ＣＤ１４阳性细胞数明显增多，荧光强度也明显增加。ＲＴ－ＰＣＲ显示，肝组织和肝细胞中ＣＤ１４ｍＲＮＡ的表达在３ｈ时明显增强，６ｈ达高峰，２４ｈ恢复正常水平；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析示肝组织和肝细胞中ＣＤ１４蛋白的表达在６ｈ明显增高，１２ｈ达高峰，２４ｈ仍有一定表达，各时相点间比较有显著差别（Ｐ＜０．０１）。结论 内毒素血症时能明显上调肝细胞ＣＤ１４基因和ＣＤ１４蛋白的表达。

Cholecystokinin octapeptide inhibits the in vitro expression of CD14 in rat pulmonary interstitial macrophages induced by lipopolysaccharide

OBJECTIVE: To study the effect of cholecystokinin octapeptide (CCK-8) on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated pulmonary interstitial macrophages (PIM) in vitro. METHODS: PIM were isolated and cultured in the presence or absence of LPS, CCK-8, proglumide (the antagonist of CCK receptors) and vehicle. The expression of membrane CD14 (mCD14) protein was assayed by flow cytometry and soluble CD14 (sCD14) in the supernatant was analyzed semi-quantitatively by Western blot. TNF-alpha in the supernatant was detected with ELISA. RESULTS: CCK-8, at concentrations of 10(-7) mol/L and 10(-6) mol/L, significantly inhibited the expression of mCD14. Release of sCD14 and TNF-alpha in the supernatant was up-regulated by LPS (1 microg/ml) but reduced by CCK-8. The effect of CCK-8 was inhibited by proglumide. CONCLUSION: CCK-8 negatively modulated several functions of LPS-stimulated PIM through CCK receptors. This may be one of the mechanisms for CCK-8 to alleviate inflammation in lung tissue during endotoxemia.