钛表面脂多糖胺纳米囊泡-透明质酸聚电解质多层膜的构建及细胞生物学效应

目的 探讨聚电解质多层膜（polyelectrolyte multilayer films,PEM）对钛表面细胞生物学效应的影响,以期为PEM用于钛种植体表面改性提供依据.方法 利用含骨形成蛋白2（plasmid of bone morphogenetic protein-2,pBMP-2）基因的脂多糖胺纳米囊泡（lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNP）（简称pLNP）作为阳离子聚电解质,透明质酸（hyaluronic acid,HA）作为阴离子聚电解质,通过层层自组装技术在碱热处理后的钛表面构建PEM,HA和pLNP在钛表面依次组装1次为1个组装循环.采用扫描电镜观察组装前后钛表面形貌.通过紫外光谱分析、表面接触角测量对不同组装循环PEM进行表征.检测大鼠骨髓间充质干细胞在自组装A组（4个组装循环,外表面为pLNP聚电解质层）、自组装B组（4.5个组装循环,外表面为透明质酸聚电解质层）、空白对照组（抛光钛）和碱热处理组（碱热处理钛）表面接种0.5和1h的黏附情况及1、3、5d的增殖情况（每组每个时间点样本量为6）.检测空白对照组、阴性对照组（膜中不含pBMP-2）和自组装A组7d的碱性磷酸酶活性及原位转染能力（每组样本量为6）.结果 扫描电镜可见自组装后钛表面被PEM覆盖,变得相对平滑.紫外光谱显示PEM在260 nm处出现DNA吸收峰,其吸光度值随组装循环数增加而增加.抛光钛经碱热处理后接触角从（62.6±4.9）°骤降至（8.1±2.2）°,组装过程中表面接触角呈锯齿状交替上升,随自组装循环数增加而增势变缓,至5.5个循环时达到（49.3±1.3）°.接种0.5和1h后自组装A组细胞黏附A值（0.415±0.085、0.426±0.048）均显著高于自组装B组（0.299±0.012、0.355±0.022）、空白对照组（0.225±0.007、0.260±0.010）和碱热处理组（0.302±0.056、0.339±0.028）（P＜0.01）.培养1、3和5d后自组装A和B组细胞增殖均显著高于空白对照组和碱热处理组（P＜0.01）.7d时自组装A组碱性磷酸酶活性（261±58）显著高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.01）.自组装A组表面具有原位转染骨髓间充质干细胞的能力.结论 钛表面可成功构建pLNP-透明质酸PEM并具有良好的细胞生物学效应.

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P<0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P<0.05),与成骨诱导液处理组相当(P>0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。

负载BMP-2质粒的脂多糖胺纳米囊泡转染大鼠BMSCs的研究

目的应用脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)作基因载体,评价其与目的基因复合及其在BMSCs中的转染情况,为LNPs介导的基因联合干细胞治疗骨缺损提供初步实验依据。方法制备加载了BMP-2质粒(plasmid of BMP-2,pBMP-2)的LNPs(plasmid-loaded LNPs,pLNPs);通过凝胶阻滞实验探究pLNPs与pBMP-2结合能力随pLNPs中N元素和P元素比例(N/P)变化的关系;透射电镜及原子力显微镜下观察pLNPs(N/P=60)形貌;动态光散射仪检测其粒径及Zeta电位;探究pLNPs耐酶解能力随时间的变化规律;体外转染大鼠BMSCs,探究不同N/P条件下pLNPs转染后细胞存活率、转染效率,及最佳N/P条件下pLNPs转染BMSCs表达目标蛋白情况。结果当N/P≥1.5时,pLNPs可完全阻滞pBMP-2;N/P为60时,pLNPs在原子力显微镜下呈大小均一囊泡状,透射电镜下pLNPs呈典型的类球形空心囊泡状,直径(72.07±11.03)nm;pLNPs粒径为(123±6)nm,Zeta电位为20 mV;pLNPs在4 h内耐DNaseⅠ酶解,6 h时对核酸保护能力稍下降。细胞存活率随N/P增加呈先增加后降低趋势,N/P为45时达最大值,N/P≤90时细胞毒性分级为1级,可用于体内实验;pLNPs转染效率随N/P增加而增大,N/?P为60时达最大值;综合确定最佳N/P为60。在N/P为60转染BMSCs条件下,4 d内细胞持续高表达BMP-2。结论LNPs能高效压缩pBMP-2形成复合物纳米囊泡,保护目的基因不被酶解,较聚乙烯亚胺25k和Lipofectamine 2000有更高的转染效率及蛋白表达量。

载基因纳米囊泡自组装多层膜组装行为研究

目的探讨构建载基因脂多糖胺纳米囊泡(NPs,简称p NPs)/透明质酸(HA)聚电解质多层膜(PEM)的组装行为和机理。方法利用含骨形成蛋白2(p BMP-2)基因的p NPs作为阳离子聚电解质,HA作为阴离子聚电解质,通过层层自组装技术在钛或石英玻璃表面构建PEM,记为Ti/Quartz-p NPs-(HA/p NPs)n,其中HA和p NPs依次组装1次为1个组装循环,n为组装循环数。采用原子力显微镜(AFM)观察膜组装过程中形貌和粗糙度值改变;膜表面Zeta电位(electric potential)表征聚电解质膜表面的电荷和吸附特性;利用耗散型石英晶体微天平(QCM-D)实时监测膜的组装过程,探索膜组装规律。结果 AFM观察发现,p NPs最初以单个离散的纳米粒子形式吸附在石英玻璃表面,随着组装进程,形成越来越粗壮、密集的"树枝"状三维立体纳米结构,膜表面粗糙度值逐渐增大。Zeta电位结果表明,石英玻璃表面经过处理后Zeta电位为-4.83 m V,首层p NPs的表面电位为正,至第3个组装循环后Zeta电位稳定在+18 m V;而HA的Zeta电位最初为负值,随组装层数增加,其表面电荷逐渐趋正;组装过程中Zeta电位呈锯齿状交替上升。石英晶体微天平测量结果显示,随着组装进行膜质量和厚度逐渐增加,且以指数型增长。结论载基因p NPs/HA通过层层自组装构建具有独特三维纳米结构的聚电解质多层膜,其增长方式为指数型,具有纳米级粗糙度和非致密性的特点。

钛表面载基因纳米囊泡自组装聚电解质多层膜的体外矿化研究

目的研究钛表面构建载基因脂多糖胺纳米囊泡．透明质酸聚电解质多层膜 （polyelectrolyte multilayer films, PEM）的体外矿化能力，为钛种植体表面聚电解质膜改性提供理论基础。方法利用含骨形成蛋白2基因质粒（plasmid of bone morphogenetic protein-2, pBMP-2）的脂多糖胺纳米囊泡（ lipopolysaccharide- amine nanopolymersomes, LNP）（简称pLNP）作为阳离子聚电解质，透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为阴离子聚电解质，采用层层自组装技术，在钛表面构建PEM，记为Ti-pLNP-（HA-pLNP）p，其中HA和pLNP在钛表面依次组装1次为1个组装循环，n为组装循环数。采用模拟体外矿化实验，检测光滑钛组（Ti）、碱热处理组（Ti-OH）、层层自组装Ti-pLNP-（HA—pLNP）。组（最外层为pLNP，简称Ti-C4）和Ti-pLNP-（HA-pLNP）4.5组（最外层为HA，简称Ti-C4．5）表面矿化物的性质、形貌和化学成分，评价聚电解质多层膜的体外矿化能力。结果X射线衍射光谱显示Ti、Ti-OH、Ti-C4和Ti—C4．5组表面在25．82°、31．90°和32．90°位置均出现了羟基磷灰石的特征衍射峰。其中Ti—OH和Ti-C4组衍射峰明显高于其他两组；场发射扫描电镜可见Ti-C4和Ti-C4．5组膜表面均匀沉积一层尺寸较大的颗粒状物，部分聚集成团片状，但钛基底仍然可见；X射线能谱显示Ti-C4和Ti-C4．5组膜表面晶状物Ca、P元素含量较接近，占总量的77．24％和64．23％，明显高于Ti组表面。结论钛表面载基因纳米囊泡自组装聚电解质多层膜具有促进体外矿化的能力。