急性痛风性关节炎患者外周血脂联素与CD4^(+)T细胞亚群的分析及相关性研究

目的比较急性痛风性关节炎患者与健康对照组外周血脂联素及CD4+T细胞亚群的差异,并探究痛风患者脂联素与血尿酸、疾病活动度、CT4^(+)T细胞亚群及部分细胞因子的相关性。方法收集急性痛风组(n=90)及健康对照组(n=72)的临床资料(包括一般资料、中性粒细胞、红细胞沉降率、C反应蛋白、血尿酸、CT4^(+)T细胞亚群及部分细胞因子);检测两组外周血脂联素水平,比较两组间外周血脂联素及CD4+T细胞亚群的差异;分析脂联素与各临床资料的相关性。结果与健康对照组比较,急性痛风组外周血脂联素水平明显降低(P<0.001),且Th2、Th17、Th17/Treg均升高(P<0.05),Treg、Th1/Th2均降低(P<0.05)。急性痛风组外周血脂联素与中性粒细胞、红细胞沉降率及C反应蛋白均呈负相关(r=-0.244,P<0.05;r=-0.311,P<0.05;r=-0.506,P<0.001),而与血尿酸无相关性。急性痛风组外周血脂联素与Th1和Th1/Th2均呈正相关(r=0.252,P<0.05;r=0.218,P<0.05)。急性痛风组外周血脂联素与白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)均呈正相关(r=0.323,P<0.05;r=0.377,P<0.05;r=0.359,P<0.05);而与白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)呈负相关(r=-0.265,P<0.05;r=-0.299,P<0.05)。多元线性回归分析显示,急性痛风组外周血脂联素与红细胞沉降率、C反应蛋白、IL-6及TNF-α均呈负相关(B _(ESR)=-12.541,P=0.003;B_( CRP)=-8.256,P=0.024;B_( IL-6)=-15.907,P=0.037;B _(TNF-α)=-79.770,P=0.040),而与Th1呈正相关(B _(Th1)=2.959,P=0.006)。结论急性痛风性关节炎患者外周血脂联素水平降低,Th2和Th17升高,而Treg降低,脂联素降低与急性痛风性关节炎患者免疫紊乱及免疫炎症相关。

脂联素基因SNP+276与延边地区2型糖尿病及其颈动脉IMT的相关性

目的探讨血清脂联素水平及其基因SNP+276基因多态性与延边地区2型糖尿病及其颈动脉内膜中膜厚度(IMT)的相关性。方法对象均来自吉林省延边地区,3代无亲缘关系,排除冠心病、肝肾疾病、恶性肿瘤及免疫系统疾病。入组人群分对照组,2型糖尿病组,2型糖尿病组按民族分为汉族与朝鲜族组;2型糖尿病组根据颈动脉IMT分为颈动脉硬化组(GG基因型组,GT基因型组,TT基因型)和无颈动脉硬化组:采用Taqman探针法进行SNP基因分型,荧光测序法进行SNP测序。结果对照组与2型糖尿病组脂联素SNP+276T/G基因多态性分布差异存在显著性:2型糖尿病组汉族和朝鲜族脂联素SNP+276T/G基因多态性分布差异无显著性;2型糖尿病动脉硬化组与无颈动脉硬化组脂联素SNP+276基因多态性分布差异无显著性;2型糖尿病颈动脉硬化组血清脂联素水平与2型糖尿病无颈动脉硬化组差异存在显著性;2型糖尿病颈动脉硬化患者GG基因型组年龄,病程和脂联素水平与TT基因型组差异存在显著性。结论脂联素基因SNP+276T/G与延边地区2型糖尿病有相关性。脂联素基因SNP+276T/G与延边地区2型糖尿病颈动脉IMT无相关性。血清脂联素水平与延边地区2型糖尿病及颈动脉IMT有相关性。脂联素是2型糖尿病及颈动脉硬化的保护因子。G等位基因可能是2型糖尿病及颈动脉硬化的风险基因。

秦川牛脂联素基因SNPs检测及其与胴体、肉质性状的相关性

利用PCR-SSCP结合测序技术对405头24月龄秦川牛脂联素基因SNPs位点进行检测,运用SPSS统计程序中的GLM模型将检测到的SNPs位点与部分胴体及肉质性状的相关性进行了分析。结果检测到AA、AB、BB、CC、CD5种基因型,其中AB、BB型个体在脂联素基因第2外显子64bp处发现G→C突变,CD型个体第3外显子50bp处发现C→T的突变,G→C导致谷氨酸(GGA)转化为谷氨酰胺(GCA),C→T导致丝氨酸(TCA)转化为亮氨酸(TTA)。方差分析结果表明:AA型个体的宰前活重、胴体重、眼肌面积显著高于BB型(P<0.05),而在胴体腿臀围方面,AA型个体极显著高于AB型、BB型个体(P<0.01)。CD型个体的宰前活重、胴体腿臀围、皮下脂肪厚、背膘厚、嫩度都显著优于CC型个体(P<0.05)。脂联素基因该位点可能是影响秦川牛胴体及肉质性状的主效QTL或与之紧密连锁,可作为秦川牛高档牛肉生产的候选分子标记。

小檗碱对3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响

目的:探讨小檗碱和胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响。方法:检测分别经小檗碱及胰岛素处理后3T3 L1脂肪细胞脂联素表达水平改变,以β actin为内对照,半定量法RT PCR测定脂联素mRNA表达。结果:经小檗碱(10μmol·L-1)干预后3T3 L1脂肪细胞脂联素表达显著增加(P<0.05),加入胰岛素后脂联素的表达受到抑制,高浓度胰岛素有显著抑制作用(P<0.05)。结论:体外实验中,小檗碱使3T3-L1脂肪细胞脂联素的表达增加,而胰岛素可抑制小檗碱增加脂联素表达的作用。

脂联素基因276位点多态性与2型糖尿病肾病的关系

目的研究山西地区汉族人脂联素基因276位点单核苷酸多态性(SNP)与2型糖尿病肾病之间的关系。方法选取262名山西地区汉族人,包括正常对照76例,2型糖尿病无肾病患者108例,2型糖尿病肾病患者78例。观测所选人群的临床指标,并针对脂联素基因276位点用聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)技术进行基因分型。结果①SNP276基因型及等位基因频率在正常对照组和2型糖尿病组之间分布差异有统计学意义(P<0.05),2型糖尿病组G等位基因频率显著高于正常对照组(P<0.01)。SNP276基因型及等位基因频率在2型糖尿病无肾病组与2型糖尿病肾病组之间分布差异无统计学意义(P>0.05)。②正常对照组GG或GT型体重指数、收缩压、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、空腹血糖均显著高于TT型。2型糖尿病无肾病组GG或GT型收缩压、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、空腹血糖均显著高于TT型。2型糖尿病肾病组GG或GT型收缩压、胰岛素抵抗指数显著高于TT型。结论在中国山西汉族人群中,与TT型相比,携带GG+GT型者患2型糖尿病的危险因素增加。G等位基因是胰岛素抵抗、2型糖尿病的危险因素;脂联素SNP276G/T与2型糖尿病相关,与糖尿病肾病无关。

脂联素基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化中表达水平变化的研究

目的:观察脂联素基因mRNA在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化。方法:体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,应用MIX、地塞米松、胰岛素诱导其分化,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时间(0～10天)脂肪细胞中脂联素基因mRNA的表达水平。结果:脂联素基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,并随脂肪前体细胞分化成熟,该基因表达水平呈逐渐上调趋势,除在诱导剂作用后第0天与第2天、第1～2天、第3～4天、第6天与第8～10天、第7～10天各时段内差异无显著性(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平差异均有显著性(P<0.05)。结论:在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中脂联素基因表达逐渐上调,可能有利于脂肪细胞的分化成熟。

健脾化痰方对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞NF-κB、脂联素和抵抗素的影响

目的观察健脾化痰方对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞NF-κB表达和脂联素、抵抗素分泌的影响,探讨其改善胰岛素抵抗(IR)的机制。方法采用细胞培养技术,将3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,通过地塞米松诱导建立IR细胞模型,将脂肪细胞分为正常组(基础培养液加10%空白组血清培养正常脂肪细胞)、模型组(基础培养液加10%空白组血清培养IR脂肪细胞)、健脾化痰组(基础培养液加10%健脾化痰组血清培养IR脂肪细胞)和吡格列酮组(基础培养液加10%吡格列酮组血清培养IR脂肪细胞),培养48 h,葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖浓度,ELISA法检测细胞培养上清液中脂联素和抵抗素量,RT-q PCR检测NF-κB表达。结果与正常组比较,模型组葡萄糖消耗量和脂联素含有量显著降低(P<0.05),抵抗素含有量显著升高(P<0.05),NF-κB表达明显上调(P<0.05);与模型组比较,健脾化痰组和吡格列酮组葡萄糖消耗量和脂联素含有量明显升高(P<0.05),抵抗素含有量显著降低(P<0.05),NF-κB表达下调(P<0.05)。结论 NF-κB、脂联素和抵抗素参与IR发生,健脾化痰方可能通过抑制IR脂肪细胞NF-κB异常表达,增加脂联素分泌、减少抵抗素分泌,改善IR。

RNA干扰对脂联素在3T3-L1脂肪细胞中表达的影响

设计合成3对ACRP30编码基因的反向重复序列,分别定向克隆至载体psilencer1.0的U6启动子下游,构建了相应的shRNAs表达质粒,并证实了这些重组质粒对成熟脂肪细胞中脂联素蛋白的表达有显著的抑制作用。

脂联素对不明原因复发性流产患者外周血Th17/Treg细胞分群及细胞因子水平的影响

目的探讨脂联素对不明原因复发性流产(URSA)患者外周血Th17/调节性T细胞(Treg)平衡的调节作用。方法以URSA患者为研究对象,健康未孕和正常妊娠女性为对照,分离血清及外周血单个核细胞(PBMC),ELISA法检测血清脂联素及Th17/Treg相关细胞因子白介素17(IL-17)和转化生长因子β(TGF-β)水平,流式细胞术观察Th17/Treg细胞分群。以不同浓度的脂联素对URSA患者PBMC进行体外干预,ELISA法检测PBMC培养上清液中IL-17和TGF-β水平,流式细胞术观察Th17/Treg分群的变化,real-time PCR检测转录因子RORγt和FOXP3 mRNA表达水平。结果 URSA患者血清脂联素水平显著降低且Th17/Treg失衡。经脂联素体外处理,URSA患者PBMC中Treg细胞比例增加,Th17细胞比例减少;培养上清液中TGF-β水平升高,IL-17水平降低;细胞FOXP3 mRNA表达上调,RORγt mRNA表达下调。上述效应均呈一定的剂量依赖性。结论 URSA患者体内存在脂联素缺乏和Th17/Treg失衡。脂联素体外处理可呈剂量依赖性地改善URSA患者PBMC中Th17/Treg失衡,提示脂联素可能通过调节Th17/Treg平衡保护妊娠。

肿瘤坏死因子α对人脂联素3T3-L1细胞PPARγ2 mRNA表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对稳定表达人脂联素3T3-L1细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ2mRNA表达的影响,为进一步研究脂联素功能提供了实验基础。方法重组脂联素真核表达质粒(pcDNA3·1+-hADPN)脂质体法稳定转染3T3-L1细胞。用TNF-α(100ng/ml)处理未转染、转染空载载体、转染pcDNA3·1+-hADPN的3T3-L1细胞,RT-PCR检测PPARγ2mRNA的表达量。结果(1)稳定转染了pcDNA3·1+-hADPN的未分化和已分化3T3-L1细胞中,PPARγ2表达量较未转染组明显增加(P<0·01)。(2)TNF-α可明显抑制PPARγ2mRNA的表达(P<0·05)。(3)稳定转染pcDNA3·1+-hADPN可改善TNF-α抑制作用(P<0·05)。结论稳定转染pcDNA3·1+-hADPN可明显增加未分化和已分化的3T3-L1细胞PPARγ2mRNA表达。TNF-α抑制PPAR-γ2mRNA表达,而转染pcDNA3·1+-hADPN可改善TNF-α抑制作用。

持续激活的Akt减少了3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白的表达

目的研究蛋白激酶B(Akt/PKB)的持续激活与灭活对3T3L1脂肪细胞内脂联素蛋白表达的影响。方法通过腺病毒表达系统将持续激活的Akt(myrAkt)和无酶活性的Akt(AktAA)导入3T3L1脂肪细胞内,应用免疫印迹法检测3T3L1脂肪细胞脂联素蛋白的表达。结果表达myrAkt的3T3L1脂肪细胞中脂联素明显减少,表达AktAA的3T3L1脂肪细胞中脂联素无明显变化。结论Akt的激活抑制了3T3L1脂肪细胞中脂联素蛋白的表达,且Akt的激活是影响脂联素的充分条件,而不是必要条件。

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。

氧化应激对3T3-L1脂肪细胞MCP-1、PAI-1、脂联素表达的影响

目的观察氧化物质第三丁基过氧化氢(t-BHP)对3T3-L1脂肪细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、1型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、脂联素的影响初步探讨氧化应激引发脂肪细胞功能障碍的可能作用机制。方法培养3T3-L1脂肪细胞,将其诱导分化为成熟的脂肪细胞,不同浓度t-BHP(100,200,300,400,500μmol/L)作用10min后继续培养。MTT比色法检测24h时3T3-L1脂肪细胞的存活率;荧光定量PCR检测8h时MCP-1、PAI-1、脂联素的表达,Real-time PCR检测t-BHP(500μmol/L,10min)作用于3T3-L1脂肪细胞后不同时间点(2,4,8,12,24h)MCP-1、PAI-1、脂联素的表达。结果 (1)t-BHP对3T3-L1脂肪细胞的存活状态无明显影响;(2)t-BHP可剂量依赖性的降低脂联素而增加MCP-1、PAI-1mRNA的表达;(3)500μmol/L的t-BHP对脂联素、MCP-1、PAI-1的调节具有时间相关性。结论氧化损伤能够促进MCP-1、PAI-1的表达、抑制脂联素的表达,这是其介导脂肪细胞功能障碍的可能机制之一。

黄芩水提液对3T3-L1脂肪细胞增殖、诱导分化及脂联素启动子荧光素酶活性的影响

目的:本研究旨在观察黄芩水提液(Scutellaria Baicalensis Water Extract,SBWE)对3T3-L1前体细胞增殖、分化,对脂肪细胞因子脂联素表达以及脂联素(Adiponectin,ADP)启动子荧光素酶活性的影响,从分子生物学角度阐述SBWE降脂作用的可能机理。方法:通过体外培养3T3-L1细胞,采用MTT法检测SBWE对3T3-L1细胞增殖能力的影响;通过诱导脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞,观察SBWE对脂肪形成的影响;化学发光法检测脂联素启动子双荧光素酶报告基因活性;荧光定量PCR法检测脂联素m RNA(Adipoq)表达。结果:与正常组相比,给予3T3-L1细胞0.01、0.1、1 mg?m L^(-1)浓度的SBWE 24 h,可显著抑制细胞的增殖活性(P<0.05);0.1、1 mg?m L^(-1)浓度的SBWE能够降低3T3-L1细胞分化为脂肪细胞的数量,并减少细胞内脂滴聚集,但无明显剂量依赖性;0.01、0.1 mg?m L^(-1)浓度SBWE能显著提高脂联素基因启动子荧光素酶活性,与空载体比较差异有统计学意义(P<0.05);与正常组相比,给予3T3-L1细胞0.1 mg?m L^(-1) SBWE 24 h,诱导前后的脂肪细胞Adipoq表达均明显增加(P<0.05)。结论 :SBWE可有效抑制3T3-L1脂肪细胞的增殖、分化,同时增加脂联素基因表达,这可能是通过增强脂联素基因启动子荧光素酶活性实现,这些为黄芩水提液减肥的作用机制提供一定的基础。

脂联素siRNA对3T3-L1细胞基础葡萄糖转运的影响

目的:构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达以及对3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运的影响。方法:设计并化学合成小鼠脂肪细胞Acrp30 siRNA片段,将其亚克隆入AdEaxy XL腺病毒载体系统,在293细胞内包装扩增为重组腺病毒。用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达。采用2-Deoxy-[3H]D-glucose掺入法测定脂肪细胞葡萄糖转运。结果:设计并构建了小鼠Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体,该载体感染脂肪细胞后,能显著抑制Acrp30 mRNA和蛋白表达,影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖的转运,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。结论:构建的Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体能有效地抑制脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的表达,从而影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运。

飞行人员代谢综合征患者脂联素基因+45和+276位点单核苷酸多态性研究

目的研究脂联素基因+45和+276位点单核苷酸多态性(SNP)与飞行人员代谢综合征(MS)的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测38名飞行人员MS患者和50名正常健康飞行人员脂联素基因+45和+276位点SNP。结果 脂联素基因SNP+45和+276基因型和等位基因在飞行人员MS组和正常健康对照组差异无统计学意义。结论脂联素基因SNP+45和+276可能与飞行人员MS无相关性。

人绒毛膜促性腺激素对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ及脂联素mRNA表达的影响

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)及脂联素mRNA表达的影响。方法:分别用50、500和5000U/LHCG干预未分化脂肪细胞2、4和6d,未用HCG干预为空白对照组,PT-PCR测定PPARγmRNA的表达;用诱导分化液(1μmol/L地塞米松+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10ng/L胰岛素)诱导3T3-L1脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定后用5000U/LHCG干预成熟脂肪细胞6、12和24h,未用HCG干预为空白对照组,用RT-PCR测定PPARγ及脂联素mRAN的表达情况。结果:不同剂量HCG干预未分化3T3-L1脂肪细胞,与空白对照组相比,不同剂量干预组未分化脂肪细胞PPARγmRNA的表达量均增加,差异有统计学意义(F=19.823、21.352和23.519,P均<0.001);不同剂量HCG干预组组间比较,5000U/L剂量干预组PPARγ的表达量较50和500U/L剂量组增加,差异均有统计学意义(P均<0.05);50和500U/L剂量组比较,PPARγmRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。5000U/LHCG干预已分化3T3-L1脂肪细胞后,空白对照组、干预6、12和24h组相比,脂肪细胞PPARγmRNA的表达差异有统计学意义(F=26.907,P<0.001),脂联素mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.066,P=0.976)。结论:HCG可能促进3T3-L1脂肪细胞的分化,但对脂联素的分泌无影响。

等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP位点方法的建立

目的:建立等位基因特异性PCR检测脂联素基因与2型糖尿病相关SNP位点的方法。方法:针对脂联素基因G531A,G545C,G11963T,T12194G和T13320C5个SNP位点设计野生型和突变型特异性引物,第一轮PCR的上游引物或下游引物与等位基因特异性引物进行半巢式PCR。在同一SNP位点如果野生型引物出现扩增产物而突变型引物未出现扩增产物,则判定该位点为野生型,反之,为突变型;如两引物均出现扩增产物则为杂合子。DNA测序证实等位基因特异性PCR检测结果。结果:该等位基因特异性PCR检测方法对研究样本均有扩增,且每个SNP位点均检出相应的野生型、突变型和混合型个体。测序结果与等位基因特异性PCR检测结果吻合。结论:建立的等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP的方法灵敏可靠,可快速检测与2型糖尿病相关的5个SNP位点。

人脂联素球状结合域蛋白对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力的影响

脂联素是由脂肪组织分泌的一种内源性生物活性多肽,其在抗动脉粥样硬化、调节糖脂代谢、增加胰岛素的敏感性等方面有重要的作用,并与糖尿病、肥胖、心血管疾病的发生有密切的关系.目前研究表明,脂联素参与调节糖代谢和胰岛素敏感性的作用可能与其增强骨骼肌和肝脏的脂肪酸氧化,促进骨骼肌对葡萄糖的摄取,抑制肝糖输出和糖异生有关 [1],但是,葡萄糖进入脂肪细胞后的代谢去路尚未清楚.gAd是脂联素的活性成分,研究证实其具有脂联素相似的生物活性,在降糖方面较全长脂联素作用更强[2].本研究用不同浓度的人脂联素球状结合域 （gAd）蛋白分别作用于3T3-L1脂肪细胞和已产生IR的3T3-L1脂肪细胞,从细胞水平观察gAd蛋白对其葡萄糖摄取能力的影响.