原代肝细胞脂肪变性细胞模型的构建

目的为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病机制和防治研究提供可靠的原代肝细胞脂肪变性细胞模型。方法采用Seglen两步灌流法及其改良方法分离获取小鼠原代肝细胞,体外培养48 h后,给予不同浓度的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)混合物(油酸∶棕榈酸=2∶1)诱导24 h,采用油红O染色,观察肝细胞内脂滴沉积情况,全自动生化分析仪测定细胞内三酰甘油(TG)含量。结果与对照组相比,模型组肝细胞内出现红色脂滴沉积,且与加入的FFA混合物浓度呈剂量依赖性;模型组肝细胞内TG含量明显高于对照组(P<0.05),且随着加入的FFA浓度升高而增加,提示肝细胞内脂质沉积随着加入的FFA浓度升高而增加。结论成功构建了原代肝细胞脂肪变性细胞模型,为NAFLD的研究提供了可靠的细胞模型。

小鼠原代肝细胞的分离培养及体外脂肪变性模型构建方法的优化

目的优化改进原代肝细胞分离培养方法并建立肝脂肪变性(hepatic steatosis)的细胞模型,以提升实验效率与准确性。方法在原代肝细胞培养及已有的脂肪变性模型上进行优化,对逆向灌注插管及固定方式进行细化,精确小鼠肝脏灌注消化的速度与时间,并在撕去肝脏包膜及过滤过程中应用含2%胎牛血清(FBS)的培养基;探索诱导脂肪变性细胞模型选用的游离脂肪酸种类、浓度与比例,精确诱导时间。结果所得小鼠原代肝细胞存活率达90%以上,量足、形态好、状态佳;所构建的脂肪变性细胞模型胞质内脂滴明显、糖脂代谢能力下降,并表现出轻度炎性反应及胰岛素抵抗状态。结论优化完善的技术手段,帮助得到稳定且模拟活体生理状态的脂肪变性细胞模型。

乙酸钠对油酸诱导的BRL-3A细胞脂肪变性的影响及机制分析

通过向油酸诱导的大鼠肝成纤维细胞(BRL-3A)脂肪变性模型中添加不同浓度(2、4、8 mmol·L^(-1))的乙酸钠,探讨其对脂肪变性细胞模型脂代谢的调控机理及细胞损伤的修复作用。试验方法:1)用不同浓度的油酸(0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48)mmol·L^(-1)刺激BRL-3A细胞24 h后,分别检测细胞相对活力、总脂滴面积、三酰甘油(TG)含量、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性,建立脂肪变性细胞模型;2)向BRL-3A细胞中添加不同浓度的乙酸钠,通过流式细胞术检测细胞凋亡率;3)用不同浓度的乙酸钠和0.12 mmol·L^(-1)油酸共同孵育BRL-3A细胞,试验分为4组,分别为油酸处理组、2 mmol·L^(-1)乙酸钠+油酸处理组、4 mmol·L^(-1)乙酸钠+油酸处理组和8 mmol·L^(-1)乙酸钠+油酸处理组,分别对细胞脂滴、TG含量、AST、ALT活性、AMPK信号通路蛋白以及脂代谢关键基因进行检测。结果显示:1)用0.12 mmol·L^(-1)油酸处理BRL-3A细胞24 h,成功建立BRL-3A细胞脂肪变性模型。2)不同浓度的乙酸钠对BRL-3A细胞凋亡率没有影响;3)4、8 mmol·L^(-1)乙酸钠处理脂肪变性细胞模型后,与油酸处理组相比,细胞总脂滴面积、每平方毫米脂滴数、TG含量、AST和ALT活性均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下降,P-AMPK表达水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上升;脂合成代谢相关基因ACC、FAS以及SCD-1 mRNA表达水平均有一定程度下降;脂分解代谢相关基因CPT-1、CPT-2以及ACO mRNA表达水平均有一定程度上升。本研究表明,乙酸钠会通过AMPK通路激活脂分解代谢,减轻肝细胞脂质蓄积,并且对油酸诱导的BRL-3A细胞脂肪变性模型的损伤具有一定缓解作用。

葱白提取物对脂肪变性肝细胞模型PPAR-α及PGC-1表达的影响

目的:观察葱白提取物对脂肪变性肝细胞模型中PPAR-α及PGC-1表达的影响,探讨其防治脂肪肝的作用机制。方法:建立游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性模型。用不同浓度葱白提取物进行干预24h后,MTT检测的细胞活性;油红O染色观察细胞内的脂滴;生化细胞内TG、ALT、AST含量;RT-PCR和Western Blotting分别检测细胞内PPAR-α、PGC-1基因的mRNA和蛋白表达。结果:游离脂肪酸诱导24h后,油红O染色显示脂肪变性;模型组TG含量较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);各组转氨酶没有明显变化;同时胞内PPAR-α、PGC-1的mRNA、蛋白表达降低。而葱白提取物各剂量组胞内的TG较模型组显著降低,差异有统计学意(P<0.05,P<0.01),并且胞内PPAR-α、PGC-1的mRNA、蛋白表达显著升高,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:葱白提取物对脂肪变性肝细胞有明显的保护作用,其机制可能与PPAR-α、PGC-1基因表达上调有关。

玳玳果黄酮提取物关键效应组分辨识及调控脂质代谢作用机制研究

目的 探究玳玳果黄酮提取物及其敲出目标组分对脂肪变性细胞调控脂质代谢作用及机制,辨识关键效应组分。方法 采用油酸诱导建立HepG2脂肪变性细胞模型,非诺贝特为阳性对照,油红O染色法及甘油三酯(triglycerides,TG)和总胆固醇(totalcholesterol,TC)为评价指标,考察玳玳果黄酮提取物、柚皮苷(目标组分)、新橙皮苷(目标组分)、其他相关组分(黄酮提取物敲除柚皮苷、新橙皮苷)、黄酮提取物敲除其他相关组分(柚皮苷-新橙皮苷6︰7)对脂肪变性模型细胞脂质集聚影响。基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信号通路,采用qRT-PCR法、Western blotting检测大鼠肝脏相关基因、蛋白的表达。结果 预防性给药后,与模型组相比,玳玳果黄酮提取物、柚皮苷、新橙皮苷、提取物敲除其他相关组分的细胞脂质积聚、TG及TC含量均有明显的改善(P<0.01或P<0.05);玳玳果黄酮提取物及柚皮苷、新橙皮苷可使促腺苷酸激活蛋白激酶(ATP-activated protein kinase,AMPK)的mRNA及磷酸化蛋白表达水平明显升高(P<0.01或P<0.05);显著抑制并明显下调固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶羧化酶(coenzymecarboxylase,ACC)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01或P<0.05);可促进过氧化物酶增殖物激活受体(peroxidaseproliferator-activatedreceptor, PPARα)、肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-l)的mRNA及蛋白表达水平明显上升(P<0.01或P<0.05);其他相关组分无明显差异。结论 玳玳果黄酮提取物及其关键效应组分柚皮苷、新橙皮苷可有效改善脂质积聚;其作用机制为激活AMPK促其蛋白磷酸化表达,从而抑制脂质合成,同时促进脂肪酸的氧化分解,由此减少脂肪沉积,发挥调控脂质代谢的作用。