自体脂肪基质细胞胶对剖宫产术后腹部切口愈合的效果评价

目的观察局部皮下注射自体脂肪基质细胞胶对剖宫产术后腹部切口的愈合效果。方法随机选取行剖宫产术的产妇120例为研究对象,按照1∶1比例随机分为治疗组和对照组,各60例。两组均采用剖宫产进行分娩,治疗组术后于切口周围局部皮下注射自体脂肪基质细胞胶治疗,对照组术后常规护理。对比两组患者术后住院天数、术后42 d瘢痕宽度、术后3个月及6个月的瘢痕指数、术后切口愈合级别以及患者满意度。结果治疗组术后住院天数短于对照组,术后3个月、6个月瘢痕指数评分均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。两组术后42 d的瘢痕宽度及术后切口愈合级别比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗组患者的满意度得分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论局部皮下注射自体脂肪基质细胞胶可减少剖宫产术后腹部切口瘢痕形成,有助于促进伤口愈合,缩短患者的住院天数,提高患者满意度。

人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能

目的 :分离人体脂肪基质细胞并诱导培养其成骨表型。方法 :将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行机械分割 ,通过Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪基质细胞 ,在BGJb 培养基中原代培养 10d ,消化传代后用含体积分数 10 %FBS及 10 - 8mol/L地塞米松 ,50mg/L左旋抗坏血酸 ,10nmol/L维生素D3 ,10mmol/Lβ 磷酸甘油钠的DMEM /F12培养基中诱导培养 14d ,观察细胞形态 ,绘制细胞生长曲线并对其成骨表型进行鉴定。结果 :脂肪基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长 ,其中的成体干细胞经诱导培养后体积明显增大 ,胞核大面圆 ,胞浆丰富 ,群体倍增时间为 66h。Gomori萘酚磷酸酯法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒 ,vonKossa染色表明聚集的细胞团能形成矿化结节。结论 :脂肪基质细胞中的成体干细胞经过矿化诱导培养后可向成骨细胞分化 。

脂肪基质干细胞的分离培养及其作为软骨种子细胞的研究

目的研究人体脂肪基质干细胞(ADSC)分离培养的方法,探讨其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力。方法取临床吸脂所得脂肪组织,胶原酶消化分离后,接种于培养基中进行原代培养,传至一代时换软骨诱导培养液进行成软骨诱导分化,定期通过阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色及免疫组化等方法进行证实。结果ADSC在体外成软骨诱导后,可向软骨细胞分化,经诱导的细胞可分泌软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原以及硫酸蛋白多糖。结论在适当诱导条件下,ADSCs有向软骨细胞分化的潜能,为软骨组织工程种子细胞来源的研究提供了新方法。

杜仲水/醇提取物促进兔脂肪基质干细胞增殖及成骨分化

背景：传统中药杜仲可以促进脂肪间充质干细胞成骨分化。目的：探讨杜仲水/醇提取物对脂肪基质干细胞的增殖作用和成骨分化影响。方法：取兔脂肪组织体外培养脂肪基质干细胞,传代3次后进行细胞增殖及成骨诱导分化。分为诱导培养基中分别含有杜仲水/醇提取物0.2,0.3,0.4,0.5g/L4个稀释度,对照组加入等量磷酸盐缓冲液。成骨诱导6d后进行各组细胞增殖活力的检测和碱性磷酸酶的测定,14d进行茜素红染色及钙化结节计数。结果与结论：杜仲水/醇提取物对脂肪基质干细胞的增殖无明显影响,但均可明显刺激上调碱性磷酸酶的活性,相同稀释度下杜仲醇提取物的调节作用大于水提取物,且在0.4~0.5g/L稀释度下对钙化结节的形成状况和数量有显著促进作用（P〈0.05）。说明杜仲水/醇提取物有促进脂肪基质干细胞向成骨细胞转化的作用,杜仲醇提取物作用优于杜仲水提取物。

心肌细胞裂解液诱导人脂肪基质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的分离培养人脂肪基质干细胞(ASCs),观察心肌细胞裂解液诱导ASCs分化为类心肌细胞的情况。方法人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化,贴壁法培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表型,向ASCs培养体系中加入乳鼠心肌细胞裂解液,培养2周后,利用免疫荧光技术和RT-PCR法分析分化后细胞的心肌特异性蛋白和基因的表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD44+、CD105+、CD31-、CD45-。心肌细胞裂解液诱导培养2周后,细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白,同时也表达心脏特异性基因cTnT、ANP、αMHC。结论心肌细胞裂解液可在体外诱导ASCs分化为类心肌细胞。

家兔脂肪基质干细胞的分离培养及多向分化诱导

背景:脂肪基质干细胞在人体皮下脂肪中储备充足,体外能快速增殖,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点。目的:体外分离培养家兔脂肪血管基质部分细胞,并验证其具有多分化潜能。方法:体外分离家兔脂肪血管基质部分细胞,在标准条件下培养,流式细胞仪检测第3代血管基质部分细胞表面标记物CD44,CD29,CD45,取第3代血管基质部分细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导,油红O染色鉴定成脂诱导,碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Vonkossa染色鉴定成骨诱导,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Ⅱ型胶原mRNART-PCR检测鉴定成软骨诱导。结果与结论:原代血管基质部分细胞为短梭形和多角形,第3代血管基质部分细胞为长梭形,流式细胞仪检测提示CD44+,CD29+,CD45-,成脂诱导组,染色油红O阳性,成骨诱导组,碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色、茜素红染色阳性,成软骨诱导组,诱导14dⅡ型胶原免疫组织化学染色阿利新蓝染色阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA显示产物条带较未诱导前信号明显增强。提示体外分离培养的家兔血管基质部分细胞具有干细胞表型,具有向成骨、软骨、脂肪细胞分化的能力,初步鉴定为脂肪基质干细胞。

利用微载体悬浮培养人脂肪基质干细胞

目的: 观察微载体悬浮培养系统(RCCS)对成人脂肪基质干细胞Adiposetissue derivedstromalcells(ADSCs)的培养效果,为大量、快速扩增组织工程种子细胞提供实验依据.方法: RCCS系统采用微载体Cytodex3为贴壁依赖性细胞ADSCs提供贴壁条件,浓度为5g/L.静止培养在12孔培养板中.两系统细胞接种密度均为1×108cells/L.分别观察细胞增殖情况,并对用RCCS培养的细胞进行细胞表型、分化能力进行检测.结果: 微载体悬浮培养9d后达到最大活细胞密度(1 60×109cells/L),静止培养第7日就达到最大活细胞密度(3. 38×108cells/L).在微载体悬浮培养条件下,ADSCs生长更为旺盛,细胞产量更高,优于静止培养. 11d后,ADSCs依然保持其干细胞特性.结论: 利用生物反映器以及微载体技术有利于ADSCs的大规模扩增,是扩增组织工程种子细胞的有效方法.

猪脂肪基质细胞成骨与成脂分化潜能的研究

目的:探索猪脂肪基质细胞体外培养和向成骨与脂肪细胞分化的条件。方法:常规方法培养猪脂肪基质细胞,分别向成骨细胞与脂肪细胞进行诱导,应用免疫组化(碱性磷酸酶法、茜素红)及油红O染色对诱导分化的细胞进行鉴定。结果:在体外培养条件下,猪的脂肪基质细胞呈成纤维样,生长旺盛,在一定的条件下,可分别被诱导分化为成骨细胞与脂肪细胞,向成骨分化的细胞表达碱性磷酸酶,在培养皿中可形成钙化斑。而在向脂肪细胞诱导分化过程中,细胞中可见有小脂滴生成,用油红O染色呈橘红色。结论:脂肪基质细胞是一种混合细胞,除了能向脂肪细胞分化外,在一定的诱导条件下,也能向成骨细胞分化。

脂肪基质干细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究脂肪基质干细胞(ASCs)的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为心肌样细胞的能力。方法获取并培养正常人的ASCs,倒置显微镜下观察其形态;流式细胞仪检测其免疫表型。5-氮胞苷诱导ASCs在体外分化为心肌样细胞,倒置显微镜观察心肌样细胞的形态,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌相关基因ANP、cTnT、cT-nI和αMHC的表达;免疫荧光法检测cTnT和结蛋白的表达;Western blot法检测Connexin 43的表达。结果ASCs呈纤维样贴壁生长,体外培养易扩增;ASCs表达相关抗原CD29和CD105,不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR;ASCs经5-氮胞苷的作用可呈现典型的心肌样细胞形态,ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT、结蛋白和Connexin 43均呈阳性表达。结论脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性,以及定向分化为心肌样细胞的能力,有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的:研究大鼠脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分离培养的方法,探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法:取成年Sprague-Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化分离,接种于自制基础培养基中分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基,诱导向成骨细胞分化,培养2～4周,用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果:大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质干细胞;经向成骨细胞诱导培养后,碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性,证实细胞能够分化为成骨细胞。结论:大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞,生物学特性与骨髓基质干细胞(mes-enchymal stem cells,MSCs)相似,能够向成骨细胞分化,有望成为组织工程的种子细胞来源。

成骨诱导脂肪基质细胞在骨组织工程体内成骨中的作用

背景:以往研究认为,经过成骨诱导后的脂肪基质细胞通过转化为成骨细胞分泌骨基质进而修复骨缺损,然而并没有明确结论证实。目的:将经过体外成骨诱导的脂肪基质细胞复合支架材料分别植入骨缺损区和非骨区,根据是否成骨,验证经过成骨诱导后的脂肪基质细胞是否转化为成骨细胞。方法:取12月龄犬背部皮下脂肪,经胶原酶消化法获得单个核细胞,将培养的第3代细胞与双相磷酸钙陶瓷形成复合物。在犬下颌骨两侧制备长20mm、高10mm的箱状缺损,拔除术区牙齿,将细胞支架复合物植入一侧术区,空白侧留作对照;另外在犬背部皮下肌肉区植入细胞支架复合物及骨诱导性磷酸钙陶瓷材料,术后6周及12周经组织学检测骨缺损修复情况。结果与结论:脂肪基质细胞复合双相磷酸钙陶瓷在骨缺损区成骨,在肌肉区未形成新骨;骨诱导性磷酸钙陶瓷在肌肉区形成新骨。提示成骨诱导并不能将脂肪基质细胞转化为成骨细胞,其确切机制有待进一步研究。

microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中的表达变化

背景:触发和控制脂肪基质细胞脂向分化的调控研究将有助于人为控制脂肪基质细胞的分化方向,促进对细胞分化的深入了解。目的:了解脂肪基质细胞脂向分化过程中microRNA-16的表达变化情况。设计、时间及地点:观察对比试验,2007-10/2008-03在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。材料:出生30d雄性体健SD幼鼠8只。成脂诱导培养液[DMEM培养液中加入地塞米松(1μmol/L)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5mmol/L)、胰岛素(10mg/L)]。方法:从SD幼鼠体内取出脂肪,采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的脂肪基质细胞,采用脂向诱导液对第3代的脂肪基质细胞进行诱导培养,并以未诱导的细胞为对照。主要观察指标:应用microRNA芯片技术检测脂肪基质细胞脂向诱导后7d和未诱导microRNA-16的表达差异。采用实时定量PCR检测microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化前后表达量变化。结果:①成功获得纯度较高的脂肪基质细胞,成功诱导其脂向分化,诱导培养后7d观察到细胞形态学上表现出典型的脂肪细胞改变:细胞相互融合,成片生长,变为细长纺锤形;PPARγ免疫细胞化学染色呈阳性;油红O染色脂滴被染成橙红色。②成脂诱导前后microRNA-16表达明显下调,诱导前microRNA-16表达量为90.25。诱导后microRNA-16表达量为56.75,③实时定量PCR结果显示microRNA-16表达显著下调,与microRNA芯片结果一致。结论:PCR及芯片结果一致支持microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中表达显著下调,可能在脂肪基质细胞脂向分化过程参与调控。

脂肪基质干细胞跨胚层分化为神经干细胞的实验研究

目的:探讨脂肪基质干细胞向神经干细胞跨胚层分化的可行性,进而为神经系统损伤修复寻找理想的种子细胞.方法:无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织,消化离心后低糖含血清培养基培养,待细胞生长至亚融合状态改用神经干细胞培养基诱导,用免疫荧光对诱导的细胞进行鉴定.结果:大鼠脂肪基质干细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的细胞,后者形成细胞球(或称"神经球"),该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快形成新的神经球.神经干细胞球进一步分化,可见到有的细胞胞体增大并出芽,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系,表达Nse或Gfap抗原.结论:大鼠脂肪基质干细胞在一定条件下可以向神经干细胞跨胚层分化.该种来源的神经干细胞可能成为中枢神经系统损伤修复的理想种子细胞.

脂肪基质干细胞对异基因树突状细胞功能的影响及机制探讨

目的研究脂肪基质干细胞(ASC)对异基因树突状细胞(DC)表型及分泌细胞因子的影响,探讨ASC发挥免疫调节作用的方式和可能机制。方法分离培养ASC,将ASC上清和ASC分别与异基因树突状细胞进行混合培养。流式细胞术检测DCCD80、CD83和CD86的表达,ELISA法检测DC分泌IL-12的水平,RT-PCR法检测吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)基因的表达。结果ASC上清与DC共培养后,使DC表达CD80、CD83和CD86减少[分别为(16.9±5.1)%、(8.4±3.7)%和(25.9±6.5)%],与对照组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05);ASC上清与ASC均能使DC分泌IL-12减少[分别为(168.3±51.2)pg/ml和(180.5±56.7)pg/ml],并使IDO基因的表达增高,与对照组比较,差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论ASC能通过细胞直接接触和分泌某些细胞因子的方式作用于树突状细胞,发挥免疫负调节作用,并参与诱导机体的免疫耐受。

猪小肠黏膜下层基质支架材料复合脂肪基质干细胞的生物相容性

背景:小肠黏膜下层具有良好的细胞、组织相容性和降解性,是一种理想的组织工程支架材料,将脂肪基质干细胞与小肠黏膜下层复合后进行定向诱导,可构建靶组织,具有一定的临床应用潜能。目的:制备脱细胞猪小肠黏膜下层基质,并检验其与家兔脂肪基质干细胞的生物相容性。方法:使用酶消化-高盐水脱细胞法处理猪小肠黏膜下层,石蜡切片检测脱细胞效果,扫描电镜观察小肠黏膜下层表面结构。体外分离培养家兔脂肪基质干细胞,分别将第3代脂肪基质干细胞单面复合和双面复合至小肠黏膜下层培养1周观察材料上下表面细胞复合情况。结果与结论:小肠黏膜下层材料为白色半透明膜状物,石蜡切片显示细胞去除彻底,扫描电镜显示小肠黏膜下层黏膜结构紧密,浆膜面纤维结构松散。脂肪基质干细胞与材料复合后,通过相差显微镜观察到细胞在小肠黏膜下层上附着生长,扫描电镜检测提示单面复合脂肪基质干细胞的小肠黏膜下层,仅在上表面有大量细胞生长,下表面无细胞或仅有少量细胞生长,双面复合脂肪基质干细胞的小肠黏膜下层上下表面均可见大量细胞融合生长,石蜡切片可见细胞贴附于材料表面生长。提示酶消化-高渗盐水法可彻底去除小肠黏膜下层表面细胞成分,小肠黏膜下层对脂肪基质干细胞的生长具有良好的支持作用。

早期应用脂肪基质血管成分技术对糖尿病足患者溃疡的治疗效果观察

目的探讨早期应用脂肪基质血管成分(stromal vascular fraction,SVF)技术对糖尿病足患者溃疡的治疗效果。方法2015年5月至2016年12月,便利抽样法选取在南京大学医学院附属鼓楼医院伤口护理室治疗的糖尿病足患者66例为研究对象。按数字随机表法将其分为观察组(n=35)和对照组(n=31)。观察组患者采用SVF技术治疗后常规换药,而对照组患者采用常规换药方法。观察两组患者的创面愈合时间、治疗总显效率及不良反应情况。结果观察组和对照组患者伤口平均愈合时间分别为(33.4±8.6)d和(41.8±5.9)d,差异有统计学意义(P<0.001)。观察组患者治疗的总显效率为85.72%,高于对照组的64.52%,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者均无不良反应。结论 SVF技术用于治疗糖尿病足溃疡患者疗效显著,无不良反应,促进了创面的愈合。

Beagle犬脂肪基质干细胞的培养及分化研究

目的:体外培养Beagle犬脂肪基质干细胞(dog adipose-derived stromal cells,dADSCs),定向诱导分化为脂肪、成骨细胞,为口腔组织工程提供种子细胞。方法:取Beagle犬皮下脂肪组织,剪碎,经I型胶原酶消化培养犬脂肪基质干细胞,取第3代细胞鉴定其来源及干细胞标记并向脂肪、成骨细胞诱导分化。结果:该细胞波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,CD44表达阳性;成脂诱导后,经油红O染色可见细胞内脂滴的积累;成骨诱导后,ALP、钙结节、骨钙素、I型胶原均阳性表达。结论:Beagle犬脂肪组织中存在着具有能分化为脂肪、成骨细胞的脂肪基质干细胞,此脂肪基质干细胞可作为口腔组织工程种子细胞来源。

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景:目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞。目的:观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。方法:手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行VonKossa钙结节染色鉴定成骨细胞。结果与结论:共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P>0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。

人脂肪基质细胞的分离、培养、增殖及传代稳定性

目的:建立人脂肪基质细胞分离、培养及扩增的方法,观察其增殖动力学行为,检测其传代稳定性。方法:通过吸脂术获取人的脂肪组织并分离脂肪基质细胞,在普通培养基中进行培养,观察细胞形态,绘制细胞增殖曲线,用油红O染色显示胞内脂滴生成,并检测其是否向脂肪细胞自动分化。结果:人的脂肪组织中可分离出基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞;其增殖曲线呈S形。在原代及传代培养中均未见脂肪细胞或胞内脂滴生成。结论:成年人脂肪组织中存在的基质细胞可维持在未分化状态下稳定的增殖和传代。

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。目的:观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。方法:利用胶原酶消化法获得SD大鼠脂肪干细胞,体外培养至第3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。结果与结论:实验组诱导3d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P<0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。