脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤

背景:有研究显示脂肪干细胞参与烫伤后皮肤组织的修复,但利用脂肪干细胞分泌物制备水凝胶,并治疗皮肤烫伤的研究尚未见报道。目的:分析人脂肪干细胞条件培养基水凝胶外用治疗小鼠皮肤烫伤模型的疗效。方法:采用酶解联合贴壁培养法,从脂肪组织培养获得脂肪干细胞并进行鉴定。取稳定增殖期细胞,收集其条件培养基,加入壳聚糖、甘露醇、β-甘油磷酸钠和透明质酸等制备温敏水凝胶,同时用新鲜脂肪干细胞完全培养基制备水凝胶。24只C57BL/6小鼠背部脱毛后用95℃铝块烫伤10 s快速建立3度皮肤烫伤模型,右侧以脂肪干细胞条件培养基水凝胶每天涂抹2次;左侧使用脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶每天涂抹2次,连续涂抹7 d,观察愈合时间与愈合进程,计算愈合率,在烫伤后第4,14,28天取材进行苏木精-伊红染色观察组织病理学变化。结果与结论:①人脂肪间充质干细胞为成纤维状,增殖旺盛,平均倍增时间为55 h,可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,高表达CD29、CD44、CD90和CD105,低表达CD31和CD34,证明其符合间充质干细胞的标准;②用人脂肪间充质干细胞条件培养基制备的温敏水凝胶在4-20℃呈现为清凉透明的黏稠液体,放入37℃15 min变为半固态凝胶;③95℃铝块烫伤小鼠表皮、真皮及皮下脂肪和肌肉组织的正常结构完全破坏,符合严重的3度烫伤标准,伤口面积均大致为3 cm^2;④在修复过程中发现,与新鲜培养基水凝胶对照组相比,脂肪干细胞条件培养基水凝胶组创口愈合时间短,伤口整洁,瘢痕增生少,创面组织结构恢复好;⑤脂肪干细胞条件培养基水凝胶组炎症浸润深度、炎症浸润细胞密度、肉芽组织厚度、成纤维细胞密度、新生血管密度和表皮厚度等指标显著好于新鲜培养基水凝胶组,差异有显著性意义(P<0.05);⑥以上结果表明,人脂肪间充质干细胞条件培养基水凝胶可有效促进烫伤皮肤伤口愈合,提高再生皮肤质量。

脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基联合骨形态发生蛋白2治疗去卵巢大鼠骨质疏松症

背景:脂肪间充质干细胞分泌各种骨重塑需要的细胞因子和生长因子,被认为是骨再生的优良候选细胞。骨形态发生蛋白2与脂肪间充质干细胞对骨再生有协同作用,并能显著增强脂肪间充质干细胞的成骨分化作用。目的:探讨脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基与骨形态发生蛋白2联合应用对大鼠绝经后骨质疏松症的影响。方法:8-10月龄雌性SD大鼠75只,随机取60只采用卵巢切除方法建立绝经后骨质疏松症大鼠模型,余15只进行假手术,未切除卵巢。将60只造模成功大鼠随机分为4组:骨质疏松症组、条件培养基组、骨形态发生蛋白2组、联合治疗组,通过尾静脉分别注射DMEM培养基、脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基、骨形态发生蛋白2、脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基联合骨形态发生蛋白2。治疗12周,取各组大鼠股骨和血清,组织学观察骨小梁数量和结构以及骨小梁间距,ELISA检测血清P1NP、ALP、TRAP、OPG、RANKL水平,Western blot、Realtime PCR检测RANKL、OPG蛋白和mRNA水平,细胞因子芯片分析脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基中细胞因子水平。结果与结论:①与假手术组相比,骨质疏松症组大鼠的骨小梁间距扩大,骨小梁数量明显减少,骨小梁失去正常结构并且不连续。与骨质疏松症组、条件培养基组、骨形态发生蛋白2组比较,联合治疗组大鼠骨小梁间距扩大较少,骨小梁结构更完整、更连续;②与骨质疏松症组、条件培养基组、骨形态发生蛋白2组比较,联合治疗组大鼠血清P1NP和ALP水平显著升高(P<0.05),血清TRAP水平显著降低(P<0.05);③与骨质疏松症组、条件培养基组、骨形态发生蛋白2组比较,联合治疗组RANKL/OPG比值显著降低(P<0.01),从而促进更多的骨形成;④脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基含有多种与骨形成密不可分的细胞因子,包括骨形态发生蛋白4和7、白血病抑制因子、脑源性神经营养因子、骨保护素、胰岛素样生长因子1等;⑤结果表明,脂肪间充质干细胞成骨分化条件培养基与骨形态发生蛋白2联合应用可减轻卵巢切除大鼠骨质疏松,可能成为治疗绝经后骨质疏松症的新方案。

胚胎干细胞条件培养基对人脂肪干细胞增殖及分化能力的影响

【目的】探究小鼠胚胎干细胞(ESC)条件培养基(CM)对人类脂肪干细胞(ADSC)增殖速率的促进作用,并研究CM对ADSC表面标志表达以及成骨成脂分化的影响。【方法】胶原酶I消化法提取人ADSC。培养2代后分普通组、40%CM组和40%ES组,分别以普通ADSC培养液、普通ADSC培养液加40%CM和普通ADSC培养液加40%ES培养液处理。3代后,用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测实验前后细胞表面标志的表达;诱导其向成骨成脂分化并鉴定。【结果】MTT法检测,40%CM组MTT吸光值显著高于ADSC组(P=0.012<0.05)。流式检测结果发现经CM培养后的ADSC,其阳性表达细胞表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105表达量无变化,阴性表达的表面标志CD31、CD45表达量降低,HLA-DR表达量增加。经过油红O染色和茜素红S染色,成脂成骨分化形成的脂滴,钙结节数目没有明显区别。【结论】ES细胞CM可以促进ADSC体外扩增,且不影响其细胞表面标志的表达及分化能力。

脂肪来源间充质干细胞条件培养基对小型猪腹腔镜肝损伤氧化应激反应的影响

旨在探究脂肪来源间充质干细胞条件培养基(adipose-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium,ADSCs-CM)对小型猪肝损伤氧化应激反应的影响,作者选取24头健康小型猪,随机分为4组,每组6只,分别为模型组(IRI)、DMEM对照组(DMEM)、ADSCs-CM治疗组(CM)和ADSCs治疗组(ADSCs)。4组均通过腹腔镜技术建立小型猪肝缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)合并部分肝切除的肝损伤模型,IRI组移植生理盐水,DMEM组移植浓缩的基础培养基,CM组移植浓缩的脂肪来源间充质干细胞培养基,ADSCs组移植脂肪间充质干细胞。各组分别于术前、术后1、3、7 d采集血液与肝组织样本,使用肝功能检测试剂盒对血清中总胆红素(T-BIL)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)进行检测;使用氧化应激检测试剂盒对肝组织中丙二醛(MDA)、髓内过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)进行检测。结果显示:术后1、3 d:模型组和对照组肝功能严重损伤,发生明显氧化应激反应,CM和ADSCs治疗组显著促进肝功能的恢复,且氧化应激相应指标较模型组和对照组表达明显下降。术后7 d,各组基本恢复到术前水平。结果显示:腹腔镜肝缺血再灌注合并肝部分切除损伤可致小型猪发生氧化应激反应,脂肪来源间充质干细胞及其条件培养基均可改善肝损伤后的氧化应激反应。

脂肪干细胞条件培养基及微针治疗脱发的研究进展

脱发是由多种毛发生长障碍引起的疾病,对患者心理有很大影响,超过50%的人有脱发困扰[1]。其中,雄激素性脱发(androgenic alopecia,AGA)和斑秃是最常见的两种脱发类型。关于脱发的药物治疗,目前,美国食品药品监督管理局批准的AGA治疗方法包括口服非那雄胺和局部应用米诺地尔[2-3]。然而,药物治疗只是延缓脱发,并且有出现不良反应的可能[3]。常用于斑秃的治疗方法为全身或局部应用激素或免疫抑制剂,治疗后患者常出现免疫抑制相关的不良反应[4]。利用干细胞进行生物工程再生毛囊的研究为脱发的治疗提供了新的途径。

脂肪间充质干细胞条件培养基通过降低细胞氧化应激水平改善皮肤衰老表型

目的探讨人脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)条件培养基(conditioned medium,CM)对改善皮肤衰老表型的影响及可能存在的作用机制。方法制备ADSCs的CM,经皮下注射到皮肤衰老裸鼠模型或应用于H_(2)O_(2)处理的成纤维细胞。采用Masson胶原染色和Weigert弹力纤维染色,以及抗Ki-67和α-SMA的免疫荧光染色观察皮肤衰老表型的改善。细胞模型中,采用CCK-8法、SA-β-gal染色、细胞SOD活性以及乙酰化酶1(sirtuin1,SIRT1)、I型胶原(collagen type I,COL-1)、Ⅲ型胶原(collagen typeⅢ,COL-3)的mRNA水平等评价CM对细胞氧化应激的改善作用。结果CM促进衰老皮肤组织中胶原蛋白的合成和弹力纤维的连续性;此外,CM通过上调ki67和α-SMA的表达水平显著促进细胞新生和血管重建。在H_(2)O_(2)处理的成纤维细胞模型中,CM显著提高了细胞增殖活性,SA-β-gal阳性染色率降低,ROS含量降低。同时,CM可显著增加H_(2)O_(2)处理的成纤维细胞中SOD活性,上调SIRT1和COL-1基因表达,并下调COL-3基因水平。结论CM可以通过减少细胞内氧化应激、提高细胞增殖活性、促进成纤维细胞中胶原蛋白合成来改善皮肤的衰老表型。

人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉促进皮肤成纤维细胞迁移、细胞外基质合成和抑制巨噬细胞炎症

目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉(hADMSCs-CMLP)对成纤维细胞(HFF-1)迁移、细胞外基质合成水平的影响,以及对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)炎症因子释放的影响。方法收集人脂肪间充质干细胞P3代细胞条件培养基上清液,经冷冻干燥后,获得冻干粉制剂。使用前用去离子水溶解,添加到人成纤维细胞HFF-1和小鼠巨噬细胞Raw264.7培养基中。用细胞划痕实验筛选冻干粉的浓度,用活细胞工作站和transwell方法检测人成纤维细胞迁移和细胞增殖情况;qRT-PCR法检测成纤维细胞细胞外基质蛋白纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白、MMP-1的mRNA水平变化;ELISA法测定巨噬细胞Raw264.7炎症因子TNF-α、IL-6释放情况。结果分离传代培养后,得到的P3代hADMSCs呈长梭形漩涡状并贴壁生长,有立体感,其间充质干细胞表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性表达率均大于95.00%,CD34、CD45、HLA-DR均小于2.00%;诱导培养21~28 d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性;细胞划痕实验显示50%的hADMSCs条件培养基冻干粉对成纤维细胞划痕修复效果最好。HFF-1细胞与hADMSCs条件培养基冻干粉共培养24 h,HFF-1细胞迁移率增加了近4倍(P<0.001);qRT-PCR结果显示,hADMSCs条件培养基冻干粉共培养处理48 h,HFF-1细胞纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白基因表达相对于对照组分别上调了2.07倍(P<0.001)、3.92倍(P<0.001)和2.37倍(P<0.001),MMP-1基因表达水平显著降低了2.98倍(P<0.001);hADMSCs条件培养基冻干粉与LPS刺激的小鼠巨噬细胞(Raw264.7)共孵育24 h,与LPS组相比,TNF-α下降了20.7%(P<0.01),IL-6下降了83.9%(P<0.001)。结论hADMSCs条件培养基冻干粉能够显著促进成纤维细胞迁移,同时促进成纤维细胞的纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白转录水平升高;hADMSCs条件培养基冻干粉还能显著抑制TNF-α和IL-6炎性因子的分泌。因此,hADMSCs条件培养基冻干粉在创伤修复、组织工程和美容抗衰领域具有一定应用潜力。

脂肪间充质干细胞条件培养基诱导结肠癌HT29细胞凋亡

目的:观察脂肪间充质干细胞条件培养基(ASC-CM)对结肠癌HT29细胞的增殖抑制作用。方法:将体外培养生长良好的HT29细胞分为两组,一组加入ASC-CM再培养(实验组),另一组加入DMEM/F12培养基再培养(对照组),然后进行如下实验:(1)分别于再培养24h、48h和72h,采用CCK-8检测两组HT29细胞增殖水平,并计算实验组HT29增殖率;(2)于再培养48h采用流式细胞术检测两组HT29细胞凋亡率;(3)再培养48h后,采用实时荧光定量PCR检测两组HT29细胞凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Survivin、XIAP的mRNA表达水平。结果:(1)与对照组比较,实验组HT29细胞24h增殖水平(吸光度OD值)无明显差异(P>0.05),培养48h、72h的OD值显著降低(P<0.01),且其增殖率下降趋势与培养时间呈明显负相关(r=-0.974,P<0.01)。(2)实验组HT29细胞ASC-CM培养48h凋亡率较对照组明显增加(P<0.01)。(3)实验组HT29细胞ASC-CM培养48h凋亡因子Caspase-3、Caspase-9mRNA表达较对照组显著升高(P<0.01),Survivin、XIAP mRNA表达较对照组显著降低(P<0.01)。结论:ASC-CM能有效抑制结肠癌HT29细胞增殖和促进凋亡。

脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤

背景:富血小板纤维蛋白可促进软组织愈合,间充质干细胞分泌的可溶性因子具有促进皮肤再生的作用,两者联合应用促进皮肤损伤修复尚未见报道。目的:探讨脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白对小鼠皮肤创伤愈合的影响。方法:制作C57/BL6小鼠(西南医科大学实验动物中心提供)全层皮肤损伤模型,随机分为4组,每组10只。自造模后即开始治疗,各组分别涂抹脂肪间充质干细胞专用培养基、脂肪间充质干细胞条件培养液、富血小板纤维蛋白、脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白,3次/d,连续7d。在治疗后的1,3,7,10 d测量创面大小并计算治疗后3,7 d的创面愈合率;治疗后第14天进行创面愈合的组织学分析。结果与结论:(1)与脂肪间充质干细胞专用培养基组相比,其他3组创面愈合时间缩短;(2)治疗后3,7 d,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于其他3组,脂肪间充质干细胞条件培养液组和富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于脂肪间充质干细胞专用培养基组,差异有显著性意义(P <0.05);(3)组织学分析显示,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组小鼠创面白细胞及成纤维细胞聚集、血管新生、肉芽组织重塑、上皮化均比其他3组明显,伤口愈合效果最好;(4)结果表明,脂肪间充质干细胞条件培养液与富血小板纤维蛋白联合应用能有效促进小鼠皮肤损伤的修复,效果优于单独应用脂肪间充质干细胞条件培养液或富血小板纤维蛋白。

人骨髓间充质干细胞通过YAP影响人脂肪肉瘤SW872细胞的生物学行为

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)条件培养基(CM)与人脂肪肉瘤SW872细胞共培养后对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响,探讨hMSCs CM对脂肪肉瘤细胞的作用及可能的作用机制。方法:体外培养hMSCs,采用慢病毒方法分别转染慢病毒空载体shNS(对照组)和慢病毒shRNA Yes相关蛋白(YAP)(shYAP-hMSCs组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平,提取CM。体外培养SW872细胞,分为对照组(正常培养)、hMSCs CM组和shYAP-hMSCs CM组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率,Western blotting法检测各组细胞中YAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,shYAP-hMSCs组hMSCs中YAP mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),表明成功构建了shYAP-hMSCs稳定转染细胞株。CCK-8法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞增殖活性升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞增殖活性降低(P<0.01);流式细胞术,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞凋亡率升高(P<0.01);细胞划痕实验,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率升高(P<0.05),shYAP-hMSCs CM组SW872细胞划痕愈合率降低(P<0.01);Western blotting法,与对照组比较,hMSCs CM组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),shYAP-hMSCs组SW872细胞中YAP、MMP-9和cyclin D1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:hMSCs参与调控人脂肪肉瘤SW872细胞增殖和迁移,其机制可能与YAP表达有关。

不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比较

背景:随着经济的发展,人们对美的追求越来越高,抗衰老研究成为当今的研究热点。干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,间充质干细胞是其中的一种。研究表明间充质干细胞能通过旁分泌作用修复损伤衰老的细胞,但对于不同来源间充质干细胞条件培养基的抗皮肤衰老作用研究甚少。目的:比较人脂肪、羊水、胎盘、脐带来源间充质干细胞条件培养基对自然衰老皮肤成纤维细胞的抗衰老作用。方法:制备人脂肪、羊水、胎盘、脐带4种不同来源的间充质干细胞条件培养基,添加到自然衰老皮肤成纤维细胞中,采用CCK-8法检测细胞活力、β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老率、DCFH-DA探针检测活性氧含量以及q PCR检测p16、p53、COL1、KLOTHO基因表达量。结果与结论:①4种间充质干细胞条件培养基均能提高皮肤成纤维细胞的活力,其中脂肪间充质干细胞条件培养基的效果最好,β-半乳糖苷酶染色率最低;②4种间充质干细胞条件培养基均能降低活性氧含量,脂肪和羊水来源间充质干细胞条件培养基组的活性氧含量最低;③p16和p53在胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组的表达均高于对照组,在羊水来源间充质干细胞条件培养基组的表达较低,脂肪间充质干细胞条件培养基组p16表达显著低于对照组,但p53的表达较高;④COL1基因表达除羊水间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,KLOTHO基因表达除胎盘间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,且脂肪间充质干细胞条件培养基组的表达最高;⑤结果显示,4种不同来源间充质干细胞条件培养基能在一定程度上延缓细胞衰老,但作用效果存在差异,其作用机制还有待进一步研究。

脂肪干细胞条件培养缓解牛磺胆酸钠和胰蛋白酶诱导的胰腺氧化应激损伤的研究

【目的】探究脂肪干细胞条件培养基(adipose-derived-stem cells conditioned medium,ADSCs-CM)缓解牛磺胆酸钠和胰蛋白酶诱导的胰腺氧化应激损伤的保护作用机制。【方法】试验选择1只中华田园犬用来分离培养脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)以制备条件培养基(conditioned medium,CM),另选9只中华田园犬随机分为对照组(CON组)、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)模型组(AP组)和CM治疗组(CM组),AP组和CM组经胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠(5%0.1 mL/kg)、胰蛋白酶(3500 U/kg)混合溶液,建立犬AP模型,CON组注射等量生理盐水。术后CM组静脉注射ADSCs-CM(0.1 mL/kg),CON组和AP组注射等量生理盐水,24 h后通过B型超声波检查胰腺回声情况和形态,采集胰腺组织样本进行病理组织学检测,采集血液样本进行犬胰腺特异性脂肪酶(cPL)、血气、血常规、生化指标检测,比色法检测血浆及胰腺总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase,T-NOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i-NOS)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)水平。【结果】B型超声波显示AP组及CM组胰腺回声不均匀,周围脂肪呈高回声。病理组织切片显示AP组胰腺肿胀出血、周围脂肪变性、十二指肠肠壁出血严重,胰腺出现间质水肿,大量炎性细胞浸润,多量细胞坏死崩解,严重出血。CM组胰腺及周围组织变化、细胞肿胀、炎性细胞浸润和出血较AP组轻微;cPL检测均为阳性。与CON组相比,AP组Cl^(-)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLB)、总蛋白(total protein,TP)含量均显著降低(P<0.05),淀粉酶(amylase,AMY)、脂肪酶(lipase,LIPA)、血浆T-NOS、胰腺i-NOS活性以及总胆固醇(total cholesterol,TCHO)、胰腺GSH含量均显著升高(P<0.05);CM组Na^(+)、Cl^(-)、GLB、TP含量均显著降低(P<0.05),AMY、胰腺GPx活性以及胰腺、血浆GSH含量均显著升高(P<0.05)。与AP组相比,CM组总CO_(2)(total CO_(2),TCO_(2))、Na^(+)、Cl^(-)、ALB、TCHO含量以及血浆T-NOS活性均显著降低(P<0.05),胰腺GPx活性、血浆GSH含量均显著升高(P<0.05)。【结论】ADSCs-CM能减轻AP模型犬胰腺损伤程度,其发挥保护作用的机制与血浆中T-NOS活性降低及胰腺GPx和血浆GSH水平增高有着密切关系,本研究可为犬AP的治疗及ADSCs-CM的应用提供理论依据。

不同炎性微环境对脂肪来源间充质干细胞增殖及分化的影响

目的:研究不同类型巨噬细胞介导的炎性微环境对脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)增殖和分化的影响。方法:利用M1、M2型巨噬细胞条件培养基(conditioned media,CMs)模拟不同的炎性微环境。分别在不同环境下(CM1组、CM2组以及Norm组)培养并诱导ADSCs。利用CCK-8法检测细胞增殖能力,茜素红染色、油红O染色以及RT-PCR检测各组细胞成骨或成脂情况。结果:CCK-8检测结果显示CM1组ADSCs增殖能力强于其他两组;茜素红染色及RT-PCR检测结果显示CM2可显著提高ADSCs成骨能力;油红O染色及RT-PCR检测结果显示CM1可显著提高ADSCs成脂能力。结论:CM1可以增强ADSCs的增殖和脂肪形成能力,CM2对ADSCs的成骨分化有显著促进作用。

脂肪干细胞无细胞提取液的治疗用途:皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复乃至神经再生

背景:脂肪干细胞无细胞提取液包括脂肪干细胞条件培养基、脂肪干细胞外泌体,因其不含细胞,易于携带、储存和运输,已成为当前最热门的治疗方法之一。目的:对脂肪干细胞无细胞提取液治疗用途的研究进展作一综述。方法:以“脂肪干细胞、基质细胞与条件培养基”“脂肪干细胞、基质细胞与外泌体”为中文检索词,“adipose stem cell,adipose stromal cell and conditioned medium”和“adipose stem cell,adipose stromal cell and exosomes”为英文检索词,由第一作者检索2005年1月至2020年3月CNKI、万方、PubMed数据库相关文章。排除重复性及缺乏原创性的文献,计算机初检得到123篇文献,最终保留62篇进行归纳总结。结果与结论:脂肪干细胞无细胞提取液在皮肤老化、创面愈合、瘢痕恢复、神经再生等多个领域具有广泛的治疗潜力,但具体作用机制尚不十分清楚,仍需进行更深入的相关研究。

细胞传代对小型猪脂肪间充质干细胞及分泌因子的影响

为了探索细胞传代对小型猪脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的影响,试验采用形态学观察法、CCK8法、Transwell迁移法、ELISA法对P3~P9代ADSCs的形态变化、增殖能力、迁移能力进行研究,并检测了传达次数对脂肪间充质干细胞的条件培养基(adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned medium,ADSCs-CM)中血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量的影响。结果表明:随着传代次数的增加,ADSCs形态发生变化,细胞折射率变低,边界逐渐不清晰;不同传代次数的ADSCs生长曲线相似,近似S型,但P3、P5代细胞增殖能力显著高于P9代(P<0.05);且P5代细胞迁移能力与P3、P9代细胞存在极显著差异(P<0.01);P5代细胞分泌VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF、IL-6能力最强,P6代细胞分泌IL-1β最多。说明细胞传代次数的增加会影响ADSCs的增殖、迁移及分泌能力。

脂肪干细胞条件培养基对不同衰老程度成纤维细胞中波紫外线损伤的修复效应

目的探讨脂肪干细胞条件培养基（adipose derived stem cell-conditioned medium,ADSC—CM）修复中波紫外线（ultraviolet irradiation B，UVB）损伤的效应。方法体外培养、获得不同衰老程度的成纤维细胞（humandermal fibroblasts，HDFs），UVB处理HDFs，造成HDFsUVB损伤，采用不同浓度ADSC—CM处理HDFs，于不同时间点取材检测不同组别HDFs的细胞增殖和衰老情况。结果ADSC-CM的浓度及处理时间分别为100%和48h最佳；对于不同衰老程度的HDFs，无论是否经过uVB处理，ADSC-CM均可较普通培养液显著提高细胞的增殖活性。结论内源性因素及外源性因素分别作用及共同作用均可引起HDFs的老化损伤，ADSC—CM可一定程度减弱HDFs的内源性、外源性老化损伤。

低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞条件培养基对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

目的探讨低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞(ADSC)条件培养基对全层皮肤缺损大鼠创面愈合的影响。方法(1)取6周龄雄性SD大鼠1只,颈椎脱臼处死,分离双侧腹股沟脂肪组织,胶原酶消化法提取第3代ADSC,观察细胞形态后用于后续实验。取细胞,采用随机数字表法(分组方法下同)分为成脂诱导组和成骨诱导组,每组各6孔。成脂诱导组培养14 d观察成脂情况,成骨诱导组培养28 d观察成骨情况。(2)取第3代ADSC,分为常氧组和低氧组,常氧组细胞置于氧气体积分数20%的常氧培养箱中培养,低氧组细胞置于氧气体积分数2%的低氧培养箱中培养。常氧组培养3 h,低氧组培养3、6、12、24、48 h,分别取3个样本,进行后续指标检测。实时荧光定量反转录PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的mRNA表达量。收集2组细胞培养上清液,离心过滤后获得常氧条件培养基(normo-CM)和低氧条件培养基(hypo-CM),酶联免疫吸附测定法检测条件培养基中VEGF、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)含量。(3)取27只6~8周龄雄性SD大鼠,分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、normo-CM组和hypo-CM组,每组9只,在其背部制作直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面并分别滴加50μL PBS、normo-CM及hypo-CM。伤后0、3、5、7、9、11 d,观察创面大体情况,测量创面面积并计算创面未愈合率。取创面组织,苏木精-伊红染色观察伤后3、9、11 d创面炎症反应及伤后9 d创面再上皮化水平;Masson染色观察伤后11 d创面胶原沉积情况,并分析胶原容积分数(CVF)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、t检验、Bonferroni校正。结果(1)细胞融合度低时呈长梭形、贴壁生长、排列紧密。培养14 d,成脂诱导组细胞经油红O染色后被染成红色的脂滴。培养28 d,成骨诱导组细胞经茜素红S染色后可见红色结节。细胞鉴定为ADSC。(2)与常氧组比较,低氧组细胞培养12、24 h HIF-1αmRNA表达量明显升高(t=5.43、5.11,P<0.05);培养6、12 h VEGF mRNA表达量明显升高(t=3.29、2.33,P<0.05或P<0.01);bFGF mRNA培养12 h表达量明显升高(t=12.59,P<0.01),培养48 h明显降低(t=9.34,P<0.01);培养3、12、24 h PPAR-γmRNA明显降低(t=5.14、6.56、4.97,P<0.05)。(3)与常氧组相比,低氧组细胞培养3、6、12、24、48 h VEGF含量明显升高(t=5.74、12.37、14.80、15.70、34.63,P<0.05或P<0.01),培养6、12、24、48 h IGF含量明显升高(t=5.65、8.06、20.12、22.99,P<0.05或P<0.01),培养各时间点TGF-β和EGF含量无明显变化。(4)伤后0~11 d,3组大鼠创面均不同程度缩小,未见明显感染、渗出等。伤后11 d,PBS组大鼠创面面积仍较大;normo-CM组大鼠创面面积较PBS组缩小,hypo-CM组大鼠创面已基本愈合。伤后7 d,normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=10.26、16.03,P<0.05)。伤后9 d,hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组和normo-CM组(t=17.25、6.89,P<0.05或P<0.01),normo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=8.81,P<0.05)。伤后11 d,hypo-CM组大鼠创面未愈合率为(2.4±1.5)%,明显低于PBS组的(20.0±5.0)%和normo-CM组的(7.7±1.7)%,t=30.15、84.80,P<0.05。(5)伤后3 d,hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显多于其余2组;伤后9 d,normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润均少于PBS组;伤后11 d,hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显少于PBS组和normo-CM组。(6)伤后9 d,hypo-CM组大鼠创面"表皮迁移舌"长度长于其他2组,表皮厚度接近正常皮肤。伤后11 d,与PBS组和normo-CM组相比,hypo-CM组大鼠创面中可见大量结构致密、排列整齐、成熟度较高的胶原沉积。PBS组大鼠创面CVF为(22.90±1.25)%,显著低于normo-CM组的(31.96±0.14)%和hypo-CM组的(56.10±1.50)%(t=12.48、29.43,P<0.05);normo-CM组大鼠创面CVF显著低于hypo-CM组(t=27.73,P<0.05)。结论低氧处理可显著增强大鼠ADSC的旁分泌作用,低氧预处理的大鼠ADSC条件培养基可通过调控炎症细胞浸润程度、促进创面再上皮化和胶原沉积,加速大鼠全层皮肤缺损创面愈合。

影响骨髓间充质干细胞分离效率的若干因素的研究

骨髓间充质干细胞来源有限,数量稀少,极大地限制了其在组织修复、细胞治疗等方面的应用。为了解决细胞数量限制的问题,从提高分离效率的角度对骨髓间充质干细胞的分离过程进行了研究,考察了培养基种类、初次换液时间、起始接种密度对兔骨髓间充质干细胞分离效率的影响。结果表明,α-MEM培养基较DMEM、DMEM-LG培养基更适于兔MSCs的分离;从骨髓中分离得到的单个核细胞以1×106 cells/ml的密度接种,接种24h后换液在短时间内得到的MSCs 数目最多。采用以上分离条件,能够获得形态均一、可稳定传代10代以上仍保持旺盛增殖能力的MSCs,并具有向骨、脂肪分化能力。

人脂肪来源间充质干细胞条件培养基对病理性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响

目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基(human adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned media,hADSCs-CM)对病理性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移能力的影响。方法分离培养hADSCs和病理性瘢痕成纤维细胞,取第3代细胞用于后续实验。于培养12、24、48 h收集hADSCs条件培养基作为实验组条件培养基(12 h-CM、24 h-CM、48 h-CM),无hADSCs的空白无血清低糖DMEM培养基置于培养箱内12、24、48 h作为对照组条件培养基(12 h-CC、24 h-CC、48 h-CC)。选取增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)、瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)以及正常皮肤成纤维细胞(NFs),分别以实验制备的培养基进行处理,每组培养基3个复孔,以CCK-8实验检测HSFs及KFs的增殖能力,以细胞划痕实验检测条件培养基处理后细胞迁移能力的变化,流式细胞仪分析细胞的周期分布、凋亡及乳酸脱氢酶(LDH)水平变化情况。实验数据以Graphpad 7.0软件进行分析,多组样本均数比较应用One-Way ANOVA,P<0.05为差异有统计学意义。结果CCK-8结果显示,24 h-CM、48 h-CM处理后24 h KFs、HSFs的增殖速度较对照组开始出现明显减慢,HSFs增殖趋势也出现了类似的变化趋势,NFs无明显的增殖趋势变化;实验组条件培养基对HSFs增殖的抑制作用在48 h达到峰值:24 h-CM KFs增殖活性为1.81±0.10,24 h-CC KFs为2.36±0.05(t=4.24,P<0.001);24 h-CM HSFs增殖活性为1.52±0.10,24 h-CC HSFs为1.96±0.15(t=8.98,P=0.001);48 h-CM KFs增殖活性为1.65±0.10,48 h-CC KFs为2.57±0.10(t=26.64,P<0.001);48 h-CM HSFs增殖活性为1.29±0.20,48 h-CC HSFs为1.94±0.10(t=11.14,P<0.001);之后抑制作用渐弱。细胞划痕实验结果表明,与对照组相比,24、48 h收集的hADSCs-CM处理后HSFs和KFs的迁移能力下降。细胞周期检测结果显示,在KFs中,12 h-CM、24 h-CM、48 h-CM组细胞处于G0/G1期的细胞比例较对照组升高,而处于S期的细胞比例则较对照组下降,在HSFs中也观察到了类似的现象。细胞凋亡检测结果显示各组NFs、KFs、HSFs未见明显凋亡。LDH漏出检测结果显示各组间无明显差异。结论hADSCs条件培养基可能通过其中含有的分泌因子抑制病理性瘢痕成纤维细胞的增殖、迁移,但不诱导其凋亡。

间充质干细胞及其细胞外囊泡促凝机制及凝血效应研究进展

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是起源于人体各种组织,如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、牙髓的一类多能干细胞[1]。MSCs的分泌组包括MSCs条件培养基、各种旁分泌/自分泌因子等以及称为细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的小泡分泌物[2]。