血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响

[目的]比较不同浓度的血清,在转化生长因子-β1(TGF-β1)存在的条件下,对脂肪成体干细胞(ad-ipose-derived adult stem cells,ADASCs)向软骨细胞分化的影响,探讨较为合适的血清浓度。[方法]取成年新西兰兔颈部脂肪组织,剪碎后通过Ⅰ型胶原酶消化,得到脂肪成体干细胞;稳定传代后,分别用含1%FBS和10%FBS的软骨诱导液干预ADASCs 2周,采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较,应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定,利用Leica病理图像软件分析两组间Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度,比较两组细胞分化的效果。[结果]MTT检测显示10%FBS组细胞增殖活性高于1%FBS组(P<0.05),两组细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,并以10%FBS组更为显著;灰度分析提示10%FBS组Ⅱ型胶原表达量高于1%FBS组(P<0.05)。[结论]体外研究表明,含10%FBS的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化,这将为作者采用这种新型的干细胞修复软骨缺损做好前期的准备。

rhBMP-2诱导脂肪成体干细胞向成骨细胞分化的量效作用

目的探讨体外条件下rhBMP-2诱导脂肪成体干细胞(adipose-derived adult stem cells,ADASCs)向成骨细胞分化和增殖的情况,并观察其量效关系。方法从成年兔颈后部获取脂肪组织,采用酶消化法分离并培养脂肪成体干细胞。稳定传代后,用不同浓度rhBMP-2对ADASCs进行诱导分化,采用碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色进行成骨细胞鉴定,采用碱性磷酸酶活性测定及MTT比色法进行分化和增殖活性比较。结果碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色为阳性;当rhBMP-2浓度在100～400ng/ml时,各组碱性磷酸酶活性提高明显(P<0.05),在400ng/ml以上各组则无明显差异(P>0.05);当rhBMP-2浓度在800ng/ml以下时,各组增殖活性无明显差异(P>0.05),在800ng/ml以上则存在明显的抑制作用,各组存在明显差异(P<0.05)。结论研究表明,在体外条件下rhBMP-2能诱导脂肪来源干细胞向成骨细胞分化;并且当其浓度在400～800ng/ml时,能促进脂肪来源干细胞的增殖和分化。

阶段性胚胎抗原-1,OCT-4,颗粒酶B在脂肪成体干细胞中的表达

目的:探索脂肪成体干细胞中是否表达胚胎时期标志蛋白SSEA-1,OCT-4,GRB.方法:先将C57小鼠脂肪用I型胶原酶消化,然后采用直接贴壁法,培养获得的细胞.取第3代生长状态稳定、形态均一的细胞进行成脂、成骨诱导分化,同时观察所培养的第3代细胞表达胚胎时期标志蛋白SSEA-1,OCT-4,GRB的情况.结果:通过该培养方法,可以获得稳定的细胞群体,并能成功进行成骨、成脂诱导分化;免疫荧光化学检测显示三种胚胎时期出现的特殊蛋白均有不同程度的表达.结论:脂肪来源的成体干细胞中表达胚胎时期的产物,这种特性可能与干细胞的多向分化特性有关系.

重组人骨形成蛋白2诱导脂肪成体干细胞向软骨分化的形态学研究

目的探索分离培养兔脂肪成体干细胞,经重组人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)定向诱导后,向软骨细胞分化的可能。方法将4月龄新西兰兔脂肪组织机械分割,通过型胶原酶消化后得到脂肪成体干细胞(adipose-derivedadultstemcells,ADASCs),采用微球方法进行培养,在rhBMP-2诱导组、重组人转化生长因子β1(recombinanthumantransforminggrowthfactorβ1,rhTGF-β1)诱导组和rhBMP-2+rhTGF-β1(共同诱导组)干预6d后,各组诱导液中分别加入维生素C50μg/ml,再干预8d,应用HE、Alcianblue、Vonkossa染色和型胶原免疫组织化学染色等组织学方法对诱导后的细胞进行鉴定。结果连续诱导培养14d后,各诱导组HE染色显示软骨陷窝形成,对照组软骨陷窝形成不明显。Alcianblue染色见细胞基质中富含蛋白多糖,胞外基质分泌较多的型胶原;但Vonkossa染色为阴性;对照组均为阴性。结论在微球方法培养下,通过相关形态学研究表明,rhBMP-2具有诱导脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的能力,将为采用ADASCs修复软骨损伤奠定理论基础。

BrdU体外标记脂肪成体干细胞的实验研究

目的探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记脂肪成体干细胞(adipose-derived adult stem cells,ADASCs)的可行性。方法将兔脂肪组织用I型胶原酶消化,分离培养ADASCs,第三代ADASCs融合约50%时,加入终浓度25mol/L的BrdU孵育48h,BrdU免疫组化染色,检测标记情况。然后通过显微镜下形态学观察、台盼蓝排斥试验、MTT试验,观测BrdU对ADASCs生长增殖的影响。结果BrdU对ADASCs的生长增殖基本没有影响。结论BrdU标记ADASCs可行且较理想。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记示踪脂肪成体干细胞体内成骨分化的研究

目的观察经成骨诱导后的脂肪成体干细胞（ADASCs）在体内的成骨分化行为。方法分离培养兔ADASCs，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记，并通过免疫组织化学方法检查标记结果。将标记的ADASCs体外成骨诱导培养2周后与脱钙骨基质（DBM）复合，共培养7d后植入自体肌袋内。术后8周取材，固定、脱钙、包埋后切片染色，镜下观察。结果大量ADASCs被标记，标记率达（82．3±8．6）％；体外标记后的ADASCs可以向成骨方向分化；切片苏木素-伊红（HE）染色示体内有新生骨形成，切片BrdU免疫组织化学染色示新生骨处有阳性细胞。结论ADASCs经体外成骨诱导后植人体内能够继续维持成骨分化，并进一步形成新生骨。

人类脂肪来源成体干细胞体外培养的生物学特征研究及供体年龄对其增殖的影响

通过研究人类脂肪组织来源成体干细胞(human adipose tissue derived adult stem cells,hADAS细胞)体外培养的生物学特征及供体年龄对其生长增殖的影响,为其作为组织工程学研究和应用的种子细胞提供实验室研究基础.取不同年龄组志愿者(<20岁、21～40岁、41～60岁和>61岁),手术中切除少量皮下脂肪组织,酶消化法分离细胞,体外培养,传至20代.取培养第3代细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原标记物(CD29,CD34,CD44,CD45,CD49d,HLA-DR,CD106)和细胞周期.细胞培养传20代后进行细胞染色体组分析.MTT法分别检测各年龄组不同时间点吸光值,绘制生长曲线,根据公式TD=t(lg2/lgNt-lgN_0)换算人类脂肪来源干细胞倍增时间(timedoubling,TD).结果显示:酶消化法自皮下脂肪组织分离细胞,体外培养hADAS细胞,流式细胞仪检测示CD29+,CD34-,CD44+,CD45-,CD49d±,HLA-DR-,CD106-;G_1期占90%(P10代);P20细胞染色体组分析显示为正常染色体,未见异常染色体,保持遗传稳定.绘制细胞生长曲线,<20年龄组TD为(11.22±0.73)h,21～40年龄组TD为(11.14±0.76)h,两组之间P>0.05,无显著性差异;41～60年龄组TD为(13.18±1.58)h,>61年龄组TD为(13.11±0.83)h,两组之间P>0.05,无显著性差异.<20年龄组TD与>61年龄组TD显著性差异,P<0.05.说明hADAS细胞可方便地取材于皮下脂肪组织,体外培养遗传特性稳定,生长活跃,青年组生长活性强于老年组,可以作为组织工程学种子细胞的新来源.