脂肪抽吸物中纤维结缔组织的成分分析

目的测定脂肪抽吸物中纤维结缔组织(以下简称"纤维")的蛋白成分及其含量和血管基质片段细胞(Stromal vascular fraction cells,SVFs)的数量。方法获取6名志愿者的脂肪抽吸物,于肉眼下拣选其中的纤维结缔组织并行HE染色观察,Western blot检测蛋白成分,ELISA测定蛋白含量,同时测定纤维中和剔除纤维后的脂肪中的SVFs细胞数量。结果HE染色观察显示纤维中含极少量脂肪;Western blot结果显示纤维中含有CollagenⅠ、Laminin、CollagenⅣ和Fibronectin;ELISA结果显示纤维中CollagenⅠ的含量为(5.122±4.581)μg/L、Laminin为(15.876±0.385)μg/L、CollagenⅣ为(4.488±4.822)μg/L、Fibronectin为(10.55±8.403)μg/L,纤维和剔除纤维后的脂肪中的SVFs细胞含量分别为(3.42±1.34)×10^4cells/mL和(1.27±0.45)×10^5cells/mL。结论纤维中主要为细胞外基质,相同体积的剔除纤维的脂肪比纤维中的SVFs含量更多。

脂肪抽吸物成分对脂肪移植的影响

自体脂肪组织是一种理想的填充材料,但其高吸收率与低存留率常导致受区无法达到预期的填充效果。脂肪抽吸物包含的细胞与蛋白成分均影响脂肪颗粒在移植区域的远期存留率。脂肪干细胞的成脂分化、血管再生以及细胞外基质重塑过程受到多种细胞及细胞因子或基质蛋白的调控。本文就脂肪抽吸物成分对脂肪移植的作用进行概述。

脂肪移植中脂肪抽吸物活性的精确调整

目的高效获取大量可用的脂肪细胞进行移植是研究的重点。手动吸脂，低重力，短时间离心和提取脂肪离心后的低层物质使可用的脂肪细胞最大化，但是这个过程用常规的设备实施很繁琐。Lipose公司（康涅狄格州格林威治）已经生产出了完成这些过程的特殊注射器、过滤器和低重力离心机（Viafill系统）。现介绍用这个系统处理后脂肪细胞的活性。方法用Viafill系统从6例女性的臀下部（n=6）和／或臀上部（n=3）获取脂肪。50g离心2min后，脂肪分为低层、中层、上层，用锥虫蓝染色分析3层物质可用脂肪细胞的数量。用标准规格的电动吸脂装置获取其余的样本，并进行同样的分析。结果离心后低层和中层细胞数量的平方根转换平均差是0．95（95％可信区间，0．61～1．30），上层和中层的差值是0．67（可信区间，0．50～0．84）。因此，低层细胞数大约是顶层细胞数的2．5～3．0倍。手动吸脂样本和电动吸脂样本的差值十分显著（1．62；可信区间，1．35—1．90）。结论本研究再次证实了笔者早期的研究，无创获取脂肪抽吸物能得到高细胞计数，而且离心后底层的脂肪细胞密度最大。Vialfill系统对脂肪移植更有效，而且使用方便，维持细胞计数与作者使用的常用设备相似。

吸脂术后人类脂肪抽吸物中脂肪细胞、基质血管细胞群和脂肪来源干细胞凋亡和坏死情况的分析

背景与目的脂肪来源干细胞已成为研究最多的成体干细胞。我们对新鲜的人类脂肪抽吸物中脂肪细胞、基质血管细胞群（stromalvascularfraction，SVF）和脂肪来源干细胞（adipose—derivedstemcells，ADSCs）的凋亡和坏死概率进行了检测。方法利用标准的吸脂术方法获取人类脂肪抽吸物（n=8）。将SVF细胞从脂肪细胞中分离出来，并经培养获取纯化的ADSCs。利用一组干细胞标记物来鉴定培养的ADSCs的表面表型。将独特的干细胞亚群（CD90^＋CD45^-、CD105^＋／CD45^-、CD34^＋／CD31^-）从SVF中挑选出来。利用膜联蛋白V／碘化丙啶实验和流式细胞术检测分析细胞凋亡和坏死情况。结果通过细胞倍增时间及油红O染色和碱性磷酸酶染色阳性证实，培养的ADSCs显示出长效增殖和分化的潜能。对脂肪抽吸物进行分离，脂肪细胞的凋亡率为19．7％±3．7％，坏死率为1．1％±0．3％；SVF细胞的凋亡率为22．0％±6．3％，坏死率为11．2％±1．9％；与脂肪细胞相比，SVF细胞有较高的坏死率（P〈0．05）。在SVF细胞中，51．1％±3．7％的细胞表达CD90^＋／CD45^-，7．5％±1．0％的细胞表达CD105^＋／CD45^-，而26．4％±3．8％的细胞表达CD34^＋／CD31^-。与表达CD105^＋／CIM5^-的AD—SCs相比，表达CD34^＋／CD31^-的ADSCs其凋亡和坏死概率更低（P〈0．05）。结论虽然ADSCs比脂肪细胞有更高的凋亡和坏死率。但在各种ADSCs亚群之间，其凋亡和坏死的程度存在明显差异。

分级脂肪抽吸物：是否存在用于脂肪移植的最佳密度

背景与目的脂肪移植的临床效果是不可预知的。本文中，我们假设离心可以产生“梯度等级密度”的具有不同特性的脂肪，可以影响脂肪抽吸物的持久性和质量。方法将人类女性脂肪抽吸物样本（10mI）以1200g速率离心3rain。弃血液和油脂成分。随后，分离出1．0ml密度最高与密度最低的脂肪，进行脂肪浸润处理及分析。将密度最高与密度最低的脂肪移植于人体FVB小鼠，然后分别于2周和10周获取组织样本，进行短期与长期持久性评价。分别通过流式细胞术和酶联免疫吸附实验，分析祖细胞数量以及血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、基质细胞来源因子．1（stromalcell—derivedfactor-1，SDF-1）、血小板来源生长因子（platelet—derivedgrowthfactor，PDGF）和脂连蛋白的表达。结果高密度脂肪与低密度脂肪相比，注射后2周[（85．4％±1．9％）：（62．3±0．1％），P=0．05]和10周[（60．8％±4．9％）：（42．2％±3．9％），P〈0．05]均表现出更高的存活百分率。而且，在高密度的脂肪抽吸物细胞群中，VEGF、基质血管成分（stromalvascularfraction，SVF）、PDGF和脂连蛋白的含量均比低密度的高（分别高出34．4％，P〈0．01；34．6，P〈0．05；52．2％，P〈0．01；45．7％，P〈0．05）。结论与低密度脂肪细胞群相比，随时间增长，高密度脂肪抽吸物细胞群可保持更高的存活百分比。因为高密度脂肪抽吸物细胞群包含更多的祖细胞和更大浓度的多种血管形成介质，所以比低密度脂肪细胞群更有助于血管形成。

人脂肪间充质干细胞生物学特征及体外向类角质细胞的分化

目的:在体外不同培养条件下,脂肪来源间充质干细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏细胞等不同胚层来源的细胞分化。观察脂肪间充质干细胞在体外培养并向类角质细胞分化的能力。方法:实验于2005-06/2006-03在解放军军事医学科学院完成。实验方法:取20～45岁健康女性(已取得患者同意)脂肪组织行脂肪抽吸术后的脂肪颗粒。参照Zuk等方法分离脂肪间充质干细胞。取培养的第3代细胞,采用流式细胞仪鉴定细胞表面分子及细胞周期。取状态良好、融合至瓶底80%的第20代细胞,在5mg/L的秋水仙素处理后采集分裂细胞,以Giemsa染色进行核型分析。取第3代细胞以5μm维甲酸和5μg/L表皮细胞生长因子培养基向角质细胞诱导分化。对照组用含体积分数为0.05胎牛血清的L-DNMEM培养基。实验评估:采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学方法检测角质细胞的标志物CK19。结果:①脂肪来源间充质干细胞表面分子CD29、CD90、CD44呈阳性,而CD34呈阴性。②细胞增殖曲线呈S型,接种的前3d细胞处于滞留期,3d后进入对数生长期,6d后进入平台期,细胞的群体倍增时间约为29h。处于对数生长期的细胞80%以上处于G0和G1期。③细胞染色体核型分析显示,染色体数目2n=46,核型46,xx,为女性正常核型。④对照组细胞贴壁后,呈成纤维细胞样,细胞呈长梭形,排列成漩涡状,贴壁较好。诱导组从诱导的第3天开始,细胞逐渐变成不规则,诱导第10天出现铺路石改变,形似角质细胞。⑤免疫组织化学方法检测显示,部分细胞专一地对CK19抗体呈阳性反应,有棕色染色。结论:可从人脂肪抽吸物中分离出间充质干细胞,脂肪间充质干细胞在体外一定条件下可向类角质细胞分化。

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定。方法酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红“O”染色定性。结果原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性。丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老。流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现VШ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红“0”染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化。

脂肪组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的分离、培养、分化和鉴定的方法,为进一步的实验研究提供理论依据。方法酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性。结果原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性。流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均呈阳性;免疫化学染色发现VШ因子、CD31、CD34,CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"O"染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化。

人类脂肪组织抽吸物中脂肪细胞、血管间质成分和脂肪来源干细胞凋亡和坏死的分析

背景与目的脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）已成为研究最多的成体干细胞。笔者对人类脂肪组织抽吸物中脂肪细胞、血管间质成分（stromal vascular fraction，SVF）和ADSCs凋亡和坏死进行分析。方法通过标准的吸脂术获取人类脂肪抽吸物（n=8）。将SVF从脂肪细胞中分离出来，并通过培养纯化ADSCs。通过一组干细胞标记物来确认培养的ADSCs的表面表型。从SVF中可分离出3种干细胞亚群（CD90^＋／CIM5^-，CDl05^＋／CD45^-及CD34^＋／CD31^-）。利用流式细胞术分析，通过膜联蛋白V／碘化丙啶检验确定细胞凋亡和细胞死亡。结果由倍增时间以及油红O染色和碱性磷酸酶染色均为阳性证明，培养的ADSCs具有长期增殖和分化的能力。从脂肪抽吸物中获取的各部分细胞中，脂肪细胞出现（19．7±3．7）％凋亡和（1．1±0．3）％坏死；SVF（22．0±6．3）％凋亡和（11．2±1．9）％坏死；SVF的坏死率较脂肪细胞高（P〈0．05）。在SVF细胞中，（51．1±3．7）％细胞表达CD90^＋／CD45^-，（7．5±1．0）％细胞表达CDl05^＋／CD45^-，而（26．4±3．8）％细胞表达CD34^＋／CD31^-。表达CD34^＋／CD31^-与表达CDl05^＋／CD45^-的ADSCs相比，其细胞凋亡和细胞坏死的概率均较低（P〈0．05）。结论与脂肪细胞相比，ADSCs有较高的细胞凋亡和细胞坏死发生概率。而在ADSCs亚群之间，细胞凋亡和细胞坏死的程度也明显不同。

从脂肪抽出物的脂类和液体部分提取脂肪来源干细胞的细胞生物学研究

目的探索从抽吸物中脂质和液体部分分离、体外培养脂肪组织来源干细胞的新方法，并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定比较。方法抽脂术后抽吸物分解为脂质和液体部分。脂质和液体部分分别用酶消化法和直接离心过滤法分离、培养ASCs，观察其在体外培养的形态学和生物学特点；MTr比色法测细胞活性，统计学分析；流式细胞仪测定细胞周期；随机选取3、4、6、8代做丫啶橙染色检测细胞的衰老；用流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达；成脂、成骨定向诱导分化，油红0染色、茜素红染色定性。结果从吸脂抽吸物的脂质和液体两部分中都能培养出大量的ASCs，分别为PLA和LAF，呈成纤维细胞样贴壁生长，MTr测定细胞活性及细胞周期研究发现PLA、LAF这两种细胞的活力与增殖能力是非常相似的；丫啶橙染色3、4、6、8代细胞无明显衰老；流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CIM4、CD34的表达均呈阳性；免疫化学染色发现vm因子、CD31、CD105、SMA表达阳性；成脂诱导分化2周后，细胞内可见有大量脂滴，油红0染色可见胞浆内有大量红染颗粒。成骨诱导2周后，细胞可见白色矿化钙盐沉积，茜素红染色可见成骨细胞红染。结论本实验建立了一种自人体脂肪抽吸物中脂质和液体部分分离和培养ASCs的新方法，经济简便实用，从成人脂肪抽吸物液体部分中也可以分离得到大量的可为脂肪组织工程所利用的ASCs，其细胞量与脂质来源的ASCs的量基本相同。贴壁的LAF与PLA细胞在细胞的生长动力学、形态学、细胞衰老、表面标志物和分化能力等方面具有非常相似的特性，都具有很强的增殖活性且衰老率较低，能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂、成骨多向诱导分化。这种经过最小限度人工干预的ASCs可能是将来脂肪组织工程比较理想的种子细胞之一。

机械微粒化的吸脂物联合点阵二氧化碳激光治疗增生性瘢痕

目前,增生性瘢痕的治疗仍然具有挑战性。富含脂肪干细胞的血管基质成分(SVF)凝胶是对脂肪抽吸物进行纯机械操作提取的,SVF对瘢痕具有治疗潜力,然而其对增生性瘢痕治疗的效果仍存在争议。该研究旨在评估SVF凝胶联合点阵二氧化碳激光治疗增生性瘢痕的效果。

脂肪移植的研究：第二部分 注射设备对脂肪物质属性的影响

目的尽管脂肪移植可以治疗多种软组织缺陷，但其结果仍有一定的不确定性。本研究中，我们将对使用一种自动、低剪切力装置或改良Coleman技术注射脂肪的物理性质进行对比。方法从9例患者处提取脂肪抽吸物，经过处理后采取改良Coleman技术或一种自动、低剪切力装置进行脂肪注射。通过一种2mm口径套管注入脂肪，并与微处理的脂肪进行对比。当组织开始失去其固态性质时，利用血流速度计测量其存储模量及剪切速率。同时，对脂肪组织的黏性进行测量，并通过载玻片实验定性评估每个治疗组的总产量。结果利用自动、低剪切力装置注射的脂肪，其物理性质与微处理的脂肪最接近。该自动装置组的脂肪存储模量（G’）比改良Coleman技术组高，而强度极限更延后。同样，测得该自动装置组的脂肪黏性与微处理组相当，比改良Coleman技术组的高。结论与改良Coleman技术相比，利用连于2mm插管的自动、低剪切力装置处理的脂肪抽吸物可以更好地保留脂肪组织完整的物理性质。本研究通过流变数据证实，该自动装置比改良Coleman技术对脂肪组织的损伤更小，其应用可能会增加移植脂肪的完整性。

用于脂肪移植及脂肪干细胞分离获取与处理技术的对比

背景与目的脂肪获取和处理技术的差异可能会影响脂肪移植的成功率。本研究利用裸鼠模型，对比不同处理方法获取的脂肪移植物的性质，并评估移植脂肪组织中存活组织的体积。方法第一阶段，通过负压吸引辅助脂肪抽吸或超声辅助脂肪抽吸2种方式获取脂肪，并利用2种孔隙尺寸的筛网进行过滤。对移植材料的如下方面进行分析：平均团块大小，油脂、脂肪和水溶性成分的构成比，以及基质血管细胞群（stromalvascularfraction，SVF）的产量。将过滤物及滤液注入无胸腺的裸鼠皮下。第二阶段，将仅通过负压吸引吸脂术中获取脂肪抽吸物，进行离心、纱布摇匀或过滤处理，然后利用相似的规范进行研究。结果与负压吸引脂肪抽吸术相比，超声辅助的脂肪抽吸术获取的脂肪在SVF含量和脂肪移植体内研究成活量情况均相似。通过超声辅助的脂肪抽吸术仅比负压脂肪抽吸术产生稍微多的油脂；通过500μm或800μm孔径的滤网进行过滤均可有效去除液体和油脂。利用纱布法处理的脂肪，其体内移植成活率和SVF产量均最高。对所有移植物的组织学分析均显示为完整的脂肪组织。结论通过超声辅助及负压吸引行脂肪抽吸术获取的脂肪，其在异种移植模型中具有相似的成活率。对于少量填充移植而要求最佳成活率的身体敏感区域而言，利用纱布摇匀的处理方式可能是用于美容性脂肪移植的最佳方法。过滤法和离心法均可有效去除液体成分，其处理过的脂肪具有相似的移植成活率，当所需移植体积较大时，这2种方法均可行。

纳米脂肪移植：基础研究与临床应用

背景与目的脂肪移植的适应证正稳步增多。微小脂肪（microfat）移植技术应用的是细注射针管。我们介绍的脂肪注射经验是利用一种更细的注射针头，细27个量度。为实现治疗目的，将脂肪制成“纳米脂肪（nanofat）”。并对其临床适应证进行描述。本文将根据研究的初步结果，对纳米脂肪的细胞成分进行确定。方法对67例患者进行纳米脂肪移植，以矫治表浅皱纹、瘢痕和下睑暗沉。对3例临床患者进行描述。在研究部分，对3份样本进行分析。第1份样本是典型的脂肪抽吸物[大脂肪（macrofat）]。第2份样本是微小脂肪，通过多端口小口针管获取。第3份样本是经微小脂肪处理获取的纳米脂肪。处理过程包括对脂肪抽吸物的乳化和过滤。对3种脂肪样本的脂肪细胞活性进行分析。定量处理基质血管成分（stromalvascularfraction，SVF）和CD34＋细胞亚群。通过在标准媒介和成脂媒介中培养细胞，探讨干细胞质量。结果在纳米脂肪样本中，未见活性脂肪细胞。而脂肪来源干细胞（adipose—derivedstemcells，ADSCs）在纳米脂肪样本中的含量却很丰富。细胞培养显示，3份样本中的干细胞具有相同的增殖和分化能力。临床结果显示，术后6个月批复质量得到显著改善。未见感染、脂肪囊肿、肉芽肿及其他不良反应发生。结论纳米脂肪注射可能会成为脂肪填充领域的一个新概念。在临床环境下，纳米脂肪可适用于皮肤年轻化的治疗。

压力和剪力在自体脂肪移植中的作用

背景与目的由于供区损伤小、并发症发生率低及恢复时间快等特点，脂肪移植已成为整形外科中的常规项目。然而，仍有待确定最佳的脂肪移植技术。压力和剪力这两种临界变量均被定义为由区域划分的力。本研究中，我们将利用裸鼠模型检验压力和剪力在人类脂肪移植中的作用。方法对新鲜脂膜切除术标本行负压肿胀吸脂术。抽吸压力位-15inHg或-25inHg。将脂肪抽吸物以1200g／min离心，并注射至裸鼠侧腹部。对脂肪抽吸物行正压力处理至6atm，保持3min，然后注射至裸鼠，以检验正压力的作用。将脂肪抽吸物以1200g／min离心3min，然后以快速（3．0～5．0ml／s）和慢速（0．5～1．0ml／s）的方式注射至裸鼠，以检验剪切应力的作用。4周后，对脂肪移植物的质量和组织学进行分析。结果作为负压力，采取高压或低压行脂肪抽吸对抽吸物的质量和组织学影响均无差别。作为正压力，4周后发现，将正压力调至6atm并保持3min并未对移植物的质量及组织学造成影响。作为剪切应力的体内研究，缓慢注射的方式比快速注射其移植物质量多38％（P〈0．01）。而两种注射方式对移植物组织学的影响相似。结论调至-0．83atm的较高的抽吸压力并未对脂肪移植物的体内存活能力造成影响。调至6atm的正压力也并未影响脂肪移植物的存活能力。而剪切应力的程度，即注射推送速率，会对脂肪移植物的存活能力造成明显的影响。用较低剪切应力缓慢注射的脂肪移植物明显比用较高剪切应力注射的好。研究数据提示，与压力相比，剪切应力是影响脂肪移植物存活能力更重要的变量。

内源性干细胞疗法促进脂肪移植存活

背景与目的对脂肪抽吸物离心可产生梯度密度的脂肪组织。高密度的脂肪中包含更多的促血管细胞因子和祖细胞，并较低密度脂肪有更高的移植存活能力。我们推测催化的骨髓来源祖细胞（bone marrow-derivedprogenitor cell，BMDPC）可对注射低密度脂肪做出反应，增加移植存活能力。方法对8周雄性FVB小鼠（n=60）选择性注射高密度人类脂肪抽吸物（n=20）或低密度人类脂肪抽吸物（／1=40）。选取接受低密度脂肪注射小鼠的半数（n=20），接受干细胞动员（活化）治疗14d。在第2周和第10周获取已移植于小鼠的脂肪，进行分析。结果低密度脂肪、每天添加AMD3100的低密度脂肪和高密度脂肪在第2周分别有（26．0±3．0）％、（61．2±7．5）％、（49．6±3．5）％的移植存活率（低密度脂肪与每天添加AMD3100的低密度脂肪相比，以及低密度脂肪与高密度脂肪相比，差异均有统计学意义，P〈0．01）。移植后第10周可观察到相似的结果。接受每天添加AMD3100的低密度脂肪移植的小鼠，其每立方厘米外周血中含有的促血管生成祖细胞较其他2组明显增多（P〈0．01），新生血管也明显较多（P〈0．01）。3种移植物中，每天添加AMD3100的低密度脂肪和高密度脂肪均含有更多的基质细胞来源因子-1α和血管内皮细胞生长因子的mRNA／蛋白。结论内源性祖细胞活化可促进低密度脂肪新血管形成，增加促血管形成细胞因子的表达，改善移植存活能力至与高密度脂肪移植相当的水平。