脂肪来源间充质干细胞移植对大鼠全层皮肤缺损的修复作用

目的探讨脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)移植在全层皮肤缺损修复中的作用。方法 25只SD大鼠制作大鼠背部全层皮肤缺损模型,随机分为3组,分别移植胶原膜(胶原膜组)、ADSCs+胶原膜(ADSCs+胶原膜组)后覆盖异体SD大鼠皮肤及直接以异体SD大鼠皮肤覆盖(空白对照组)。观察各组创口的愈合速度,并通过愈合皮肤抗拉力实验、HE染色、原位杂交的方法检测愈合后皮肤的抗拉性、组织学改变及ADSCs的表达。结果 ADSCs及胶原膜对大鼠一般情况无明显影响;ADSCs+胶原膜组创面愈合率为(94.24±3.13)%,显著高于空白对照组的(84.57±2.42)%及胶原膜组的(84.72±9.70)%,差异有统计学意义(P<0.05);ADSCs+胶原膜组皮肤的最大拉力、弹性位移和拉伸率与空白对照组及胶原膜组比较差异无统计学意义(P>0.05);ADSCs+胶原膜组皮肤真皮层中存在大量类似于正常皮肤的毛囊结构;在ADSCs+胶原膜组愈合创面皮肤组织中可追踪到雄性大鼠来源细胞的阳性表达。结论 ADSCs能促进大鼠全层皮肤缺损的修复。

蒙古马脂肪来源间充质干细胞体外成脂和成骨诱导分化

取蒙古马背臀部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),经过原代培养和传代培养,分别加入成脂诱导剂和成骨诱导剂培养,采用倒置显微镜观察诱导后的细胞形态变化,并通过油红O染色和茜素红染色法对其脂肪细胞和成骨细胞表型进行鉴定.结果显示:ADSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成脂、成骨诱导培养2周后形态、体积发生明显改变.经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节.说明马ADSCs经体外诱导培养后可向脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成脂和成骨表型,表明ADSCs具有多向分化潜能.

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5-7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为（88±2）%,（12±2）%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。

兔脂肪来源间充质干细胞的生物表型及其心肌样细胞的分化潜能

目的鉴定兔脂肪来源间充质干细胞(ADMSCs)的生物学表型及其向心肌细胞分化的潜能。方法成年兔肩胛区皮下脂肪组织经消化、培养,观察其形态变化。第3代细胞进行CD29、CD34、CD44、CD105免疫细胞化学显色、免疫荧光单标、双标及三标显色。5-氮杂胞苷(5-aza)诱导ADMSCs 7d,免疫组织化学和免疫荧光技术显示肌钙蛋白-I(Troponin-I)和肌球蛋白重链(MHC)表达。光学显微镜和激光扫描共焦显微镜观察并计数。结果ADMSCs开始为圆形,后逐渐伸展,呈现形态多样性。90%以上的第3代细胞阳性表达CD29、CD44、CD105,三者共表达于胞质中。CD34阴性表达。CD分子表达阳性的细胞70.59%±1.26%表达Troponin-I,71.98%±1.13%表达MHC。结论 90%以上的ADMSCs共表达干细胞表面标记CD29、CD44、CD105,它们具有很强的分化为心肌样细胞的潜能。

miR-424在人脂肪来源间充质干细胞成骨分化中的调控作用

目的探讨miR-424在人脂肪来源间充质干细胞(h ASC)成骨分化中的表达及miR-424对h ASC体外成骨分化的生物学作用。方法 q PCR检测miR-424在h ASC成骨分化不同阶段的表达水平。通过慢病毒颗粒在体外感染h ASC,使miR-424过表达或抑制其表达,进行Western blotting、细胞免疫荧光试验及碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色试验,研究miR-424对骨形态发生蛋白2(BMP-2)及成骨诱导液诱导h ASC成骨分化过程的影响。预测miR-424的靶基因,并利用q PCR及Western blotting验证。结果 q PCR结果显示miR-424在h ASC的表达量随着成骨诱导时间延长逐渐下降(P<0.05)。在BMP-2诱导下,过表达组的碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)蛋白水平均下降,而抑制组的表达增加(P<0.05)。细胞免疫荧光显示,过表达miR-424的细胞骨唾液酸蛋白(BSP)阳性率显著下降(P<0.05)。ALP和ARS染色显示,过表达组ALP活性降低,钙盐沉积下降,而抑制组ALP活性升高,矿化能力增强。过表达miR-424能降低h ASC中Smad5的mRNA和蛋白水平,而抑制miR-424则使其水平升高(P<0.05)。结论 miR-424在h ASC成骨分化中表达下调,其在hASC体外成骨分化过程中起抑制作用。

骨髓和脂肪来源间充质干细胞的免疫调节作用

背景:脂肪来源的间充质干细胞是否具有和骨髓来源间充质干细胞类似的免疫调节作用?目的:观察骨髓来源和脂肪来源间充质干细胞的免疫学特征。方法:分离骨髓和脂肪来源的间充质干细胞,分别检测它们对T细胞周期、活化、抑制和增殖的作用情况。结果与结论:骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞同样具有抑制T细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T细胞增殖中这种作用都是具有剂量依赖性的,在1︰2时有极强的抑制作用,但是在1︰100时这种作用基本消失,在共培养时骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞都可以使更多的T细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T细胞的早期活化,但是上述作用脂肪来源的间充质干细胞均较骨髓来源间充质干细胞弱,且脂肪来源的间充质干细胞并不具有抑制T细胞凋亡的作用。

脂肪来源间充质干细胞的成软骨分化及其在膝关节软骨损伤修复中的研究进展

膝关节软骨损伤是导致膝关节疼痛和功能障碍的主要原因,但目前临床应用的软骨修复方法存在一定局限性。随着组织工程技术的不断发展,脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)为软骨损伤修复提供了更好的选择。ADSCs具有增殖速度快、免疫抑制性强、来源广泛以及良好的成软骨分化潜能等生物学特性,已逐步应用于膝关节软骨损伤修复。未来还应深入研究ADSCs的成软骨分化机制,从生长因子以及三维诱导环境等方面探索ADSCs在膝关节软骨损伤修复中的进一步应用。

脂肪来源间充质干细胞与免疫调节因子间作用的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的非造血多能干细胞,可以分化为成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元干细胞、胰岛样细胞等。MSCs具有免疫调节特性,可通过分泌吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)和前列腺素E2(PGE2)来发挥免疫调节作用,同时又能在炎性因子如干扰素γ(IFN-γ)的预刺激下增强其免疫调节功能。研究发现,在脂肪组织中存在丰富的,使MSCs成为成年干细胞非常有吸引力的来源。本文对目前脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)和以上3种免疫调节因子之间相互作用的研究进展作一综述。

人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法

目的研究人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,h ADSCs)的制备及其质量检验方法,为临床研究提供安全合格的干细胞。方法取50例人吸脂术抽取的脂肪,剪碎,用胰酶和胶原酶消化、分离、培养,并按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》对其进行细胞形态、数量、活率、无菌、支原体、人源特定病毒及猪源病毒、内毒素、免疫抑制活性、分化能力、免疫表型等检测及染色体核型。结果 50例h ADSCs;细菌、内毒素检测阴性,无内外源致病菌;干细胞免疫表型检测CD90、CD105表达阳性,阳性率>95%,CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,阳性率<2%;具有成骨、成脂分化潜能;能抑制异体淋巴细胞的增殖。间充质干细胞活性冻存前≥92%,冻存复苏后≥82%。结论按照本工艺及标准制备的h ADSCs符合质量控制标准,为同类干细胞制备及其检定过程标准化提供了试验依据。

鞘氨醇激酶1修饰的脂肪来源间充质干细胞对组织工程化骨成骨效果的影响

目的研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)修饰的脂肪来源间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSC)对组织工程化骨成骨能力的影响。方法将从SD大鼠脂肪细胞中分离提取的ADSC分为对照组(CON组)与实验组(SPK1组),分别感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒,在感染病毒14 d后,分别使用茜素红和油红O染色,检测A_(595 nm)和A_(490 nm)以判定成骨、成脂能力,检测两组成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化。构建SD大鼠股骨缺损模型,在CON与SPK1两组ADSC与β磷酸三钙陶瓷(β-TCP)结合后,将组织工程骨填压至缺损处,4、6周后X线检测大鼠骨缺损修复情况,Western blot检测SPK1、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein,BMP7)表达变化。结果流式细胞仪检测CON和SPK1慢病毒感染效率分别为94.4%、94.9%;CON和SPK1组SPK1蛋白相对表达量分别为(0.73±0.10)vs.(1.29±0.17),P<0.05;CON和SPK1组A_(595 nm)分别为(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01),A_(490 nm)分别为(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02),均P<0.05。CON与SPK1的ALP活性分别为(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09),P<0.01。在骨缺损修复中,第4周SPK1组大鼠骨缺损处形成的高密度组织面积显著大于CON组,在第6周时SPK1组大鼠骨缺损治愈,而CON组则尚有缺损。CON和SPK1组在感染病毒48 h后BMP7相对表达量分别为(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23),P<0.05。结论 SPK1修饰的ADSC体外、体内成骨能力增强,其机制可能与BMP7激活相关。

脂肪来源间充质干细胞在自身免疫性疾病中的应用进展

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AIDs)的发生发展是由于患者自身免疫耐受能力下降甚至被破坏,机体内部产生过多的自身抗体和(或)致敏性淋巴细胞,从而造成相关的组织病理变化和临床表型。目前临床上治疗该类疾病的主要方式仍是以药物为主的非特异性免疫抑制疗法,虽然在一定程度上可以缓解患者症状,但对于重症患者来说,效果往往不理想。近些年来,随着对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的深入研究,人们对其特性的认识从具有高度自我更新与分化能力,逐渐扩展到免疫调节功能方面。与此同时,基于MSCs的研究方向也逐渐从最初的再生医学转向自身免疫学领域。随着大量相关的临床前和临床试验的开展,脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的局部或全身应用被认为是临床上治疗自身免疫疾病的有效手段之一。该文就AD-MSCs的生物学特性及其在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、1型糖尿病、炎症性肠病、系统性硬化、银屑病等AIDs中的应用进行阐述并提出展望。

艾塞那肽通过SDF-1/CXCR-4/Rho GTPase通路增强脂肪来源间充质干细胞的趋化性迁移

目的探究艾塞那肽对脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)迁移的影响,并证实Rho GTPase为SDF-1/CXCR-4迁移通路的下游效应蛋白。方法分离并培养大鼠来源ADSCs并通过流式细胞术及体外诱导分化鉴定。应用RTCA x CELLigence系统检测艾塞那肽对ADSCs增殖能力的影响。Transwell观察不同浓度艾塞那肽,AMD3100(CXCR-4阻断剂),CCG-1423(Rho GTPase阻断剂)处理对ADSCs趋化性迁移能力的影响。流式细胞术及Western blot技术分别检测不同艾塞那肽浓度处理组细胞CXCR-4蛋白表达水平。活化的Rho蛋白pull-down检测试剂盒检测艾塞那肽处理组和AMD3100阻断组Rho GTPase表达情况。激光共聚焦显微镜观察不同处理组细胞应力纤维形成情况。结果 RTCA x CELLigence系统提示艾塞那肽处理24h内对ADSCs的增殖能力无明显影响。艾塞那肽呈浓度依赖性的增加ADSCs的趋化性迁移能力,AMD3100及CCG-1423可阻断这种效应(P<0.05)。流式细胞术及Western blotting结果都表明CXCR-4蛋白随艾塞那肽处理浓度升高而表达上调。此外,Western blot实验证实Rho GTPase的表达受SDF-1/CXCR-4通路影响。共聚焦显微镜观察到应力纤维的形成与SDF-1/CXCR-4/Rho GTPase通路相关。结论艾塞那肽能增强ADSCs的趋化性迁移能力,Rho GTPase为SDF-1/CXCR-4经典归巢通路的下游效应蛋白。

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。

脂肪来源间充质干细胞治疗免疫性皮肤病研究进展

脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)是一类非造血的异质性细胞群,其具有广泛生物学功能、有独特的自我更新能力,可以分化为多种不同细胞类型,常被应用于软组织修复工程。有研究证实,它们可以调节免疫系统,进而用于免疫性疾病的治疗。本研究就近年来ADSCs的免疫调节功能和在免疫性皮肤病中相关应用的研究进展作一综述,为其在此类皮肤病治疗的应用提供参考。

脂肪来源间充质干细胞治疗宫腔粘连的临床前研究

目的探讨自体脂肪间充质干细胞(ADSCs)对宫腔粘连的修复作用及可能涉及的分子生物学机制。方法取C57BL-6雌性小鼠32只,分为4组,每组8只。假手术组剖腹后缝合,不接受治疗;磷酸盐缓冲液(PBS)模型组剖腹后在子宫壁反复搔刮20次进行建模,关腹后7 d再次开腹,双侧子宫角注射PBS 10μL;ADSCs组于建模7 d后再次开腹,双侧子宫角注射自体ADSCs;ADSCs+3D细胞水凝胶(ShakeGel^(TM)3D)组于建模7 d后,双侧子宫角注射ADSCs+ShakeGel^(TM)3D。治疗7 d后处死小鼠,收集双侧子宫,包埋切片后进行H-E和Masson染色,计算子宫内膜厚度、腺体数量和子宫内膜的纤维化面积,评价利用ADSCs和ADSCs+ShakeGel^(TM)3D治疗宫腔粘连的疗效。结果ADSCs组和ADSCs+ShakeGel^(TM)3D组小鼠的子宫内膜厚度和腺体数量明显增加,子宫内膜纤维化面积明显减少,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达水平降低,骨形态发生蛋白-7(BMP7)和Smad5的表达水平则提高。结论自体ADSCs和ADSCs+ShakeGel^(TM)3D可通过BMP7/Smad5通路增加子宫内膜的厚度和腺体的数量,并降低子宫内膜纤维化程度,促进子宫内膜组织修复,恢复其部分功能,起到治疗宫腔粘连的作用。

茶多酚对人脂肪来源间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨茶多酚(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)成骨分化的影响。方法利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs,倒置显微镜下观察各代hADSCs的形态学特点;利用流式细胞术检测各代hADSCs免疫学表型;取P3代细胞进行成骨诱导分化,实验分三组,即未诱导组、常规成骨诱导组与EGCG组(常规成骨诱导+5μmol/L EGCG),14 d后,镜下观察细胞形态学改变及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果体外分离、培养的hADSCs形态均一;流式细胞术结果显示hADSCs具备间充质干细胞的免疫学表型,即CD44、CD73、CD105阳性;成骨诱导14 d后部分细胞由长梭形变成多角形,细胞呈现聚集趋势;ALP染色显示EGCG组呈强阳性。结论成功的从脂肪组织中分离培养出了hADSCs,EGCG能加强其成骨分化能力,这将为骨质疏松症的临床药物开发提供新的思路,亦为组织工程骨的构建提供丰富可靠的种子细胞来源。

脂肪来源间充质干细胞对免疫性脱发的治疗作用及机制研究

目的探讨脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)对免疫性脱发的影响。方法采用Transwell小室(0.4μm)将人源ADSCs和毛囊真皮乳头细胞(DPCs)共培养,通过CCK-8法观察共培养后DPCs增殖能力的变化,并通过实时荧光PCR检测共培养DPCs诱导能力的变化。将40只雄性C57BL/6小鼠随机分成4组:空白对照组、免疫性脱发组、脂肪干细胞治疗组、糖皮质激素治疗组。通过建立小鼠免疫性脱发模型,观察各组小鼠脱毛区皮肤颜色变化和新生毛发生长状况,计算各组小鼠新生毛发长度、质量,通过苏木精-伊红染色(H-E)观察各组小鼠毛囊数量和形态差异,通过免疫组化观察毛囊周围炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和内皮细胞黏附分子-1(ELAM-1)水平和免疫因子CD4^(+)、CD8^(+)水平。结果研究发现ADSCs可以有效促进DPCs的增殖能力,增强DPCs的分泌功能(P<0.01)及DPCs诱导毛囊形成的能力,促进毛囊进入生长期。在免疫性脱发小鼠模型中,经ADSCs混合培养基注射治疗,小鼠毛发质量增加,毛发生长情况改善(P<0.05),H-E及免疫组化结果显示ADSCs可以下调毛囊周围的免疫功能,降低局部炎症因子水平。结论局部ADSCs混合培养基注射可以治疗免疫性脱发,可能与调节局部免疫微环境及抑制炎症因子对毛囊的破坏有关。提示ADSCs局部应用可以作为难治性免疫性脱发治疗的新思路。

人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立

目的探讨建立生物学性状稳定的人脂肪来源间充质干细胞(h ADSCs)库的可行性,旨在为组织工程种子细胞提供更多来源。方法对分离得到的h ADSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原,在诱导培养基中对其进行成脂和成骨诱导培养,光镜下观察细胞形态,免疫组织化学方法检测成骨诱导的特异标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达,观察h ADSCs在复苏前后的分化能力。结果从脂肪组织中分离培养扩增获得数目稳定的h ADSCs,经冻存并复苏后的h ADSCs形态和表面抗原保持不变,可继续扩增10代以上,倍增时间为48h。复苏后第2、第6、第10代h ADSCs均保持了较强的成脂及成骨分化能力。结论初步建立h ADSCs库,可为再生医学修复重建组织工程提供较好的种子细胞。

犬脂肪来源间充质干细胞对重症急性胰腺炎体外内质网应激模型的抗凋亡作用

【目的】探究犬脂肪组织来源的间充质干细胞(cAd-MSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)体外模型的抗凋亡作用,以期为利用干细胞治疗胰腺炎提供理论指导。【方法】①用Ⅰ型胶原酶消化分离cAd-MSCs,用流式细胞术鉴定其干细胞标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达,用成脂、成骨和成软骨分化来鉴定其多向分化潜能;②用Ⅰ型胶原酶从小鼠胰腺组织中分离胰腺腺泡细胞(PACs),用实时荧光定量PCR检测PACs及胰腺组织中胰腺导管特异性基因CK19、β-胰岛细胞特异性细胞基因Insulin-1、α-胰岛细胞特异性基因Glucagon及PAC特异性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B的表达;③以10、20μg/mL脂多糖(LPS),10、100 mmol/L雨蛙肽(Caerulein)以及10μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein处理PACs,不添加药物培养的细胞为对照组,培养24 h后使用CCK-8检测PACs存活率,筛选体外构建内质网应激模型的最佳处理组(即模型组,P);用CCK-8检测对照组(Naive)及模型组(P)细胞0、2、4、8、12和24 h的存活率,Western blotting检测P组细胞内质网应激相关蛋白的相对表达量;④为确定cAd-MSCs对PACs的作用方式,试验分为PAC组(仅PACs,Naive)、P组、间接共培养组(IC)、直接共培养组(构建PAC模型时与cAd-MSCs直接共培养,DC),用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)基因在PACs中的表达水平;⑤在间接共培养系统中,将细胞分为空白对照组(仅PACs,Naive)、对照组(PACs与cAd-MSCs共培养,C)、P组及试验组(药物处理的PACs与cAd-MSCs细胞共培养,T),细胞培养12 h后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平的变化,并用TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。【结果】①分离培养的cAd-MSCs呈现成纤维样细胞形态,高表达干细胞标志物CD29、CD44、CD73及CD90,不表达CD34和CD45,且具备成脂、成骨、成软骨分化能力;②分离的原代PACs呈鹅卵石样,与胰腺组织相比较,AMY2B、CPA1、PTF1α基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),CK19、Glucagon、Insulin-1基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。③与对照组相比,10μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein组细胞存活率极显著降低(P<0.01),因此选为构建内质网应激模型的最佳处理组。与对照组相比,4 h时P组PACs的细胞存活率显著降低(P<0.05),8、12、24 h均极显著降低(P<0.01);Western blotting检测结果显示,Grp78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达水平自4 h开始均极显著增加(P<0.01)。④与Naive组相比,P组TNF-α基因的表达水平极显著增加(P<0.01);与P组相比,IC和DC组TNF-α基因表达水平均极显著降低(P<0.01),后续用间接共培养系统进行试验。⑤在间接共培养系统中,与P组相比,T组Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。TUNEL检测结果显示,T组阳性细胞数明显减少。【结论】本试验成功构建SAP体外内质网应激模型,且证明cAd-MSCs对PACs内质网应激具有调控及保护作用。

体外诱导脂肪来源间充质干细胞间质-上皮转换

目的探讨在体外诱导人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSCs)发生间质-上皮转换(MET)的可行性。方法从人脂肪中分离、培养间充质干细胞,流式细胞术鉴定其细胞表面标志。在体外添加激活素A(activin A)、维甲酸(RA)和骨形态发生蛋白7(BMP7)培养后,倒置显微镜下观察hAD-MSCs诱导后的形态变化,采用RT-PCR方法检测间质和上皮细胞相关基因vimentin,E-cadherin,ZO-1和β-catenin在诱导分化过程中表达水平改变。Western blot检测诱导前后间质标记vimentin和上皮标记β-catenin的表达。结果诱导后细胞形态发生改变,由长梭形变为卵圆形,上皮标记基因E-cadherin,ZO-1和β-catenin的mRNA表达显著上调(P<0.05),同时间质标志基因vimentin的mRNA表达显著下降(P<0.05)。Western blot结果显示,与未诱导组相比,诱导后细胞开始表达β-catenin,而vimentin的表达明显下降(P<0.05)。结论 Activin A、RA和BMP7联合使用可诱导hAD-MSCs发生MET的过程。