背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6...背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6基因在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法:利用PCR法从人Pax6 cD NA基因克隆载体p GEM-PAX6上扩增Pax6目的片段,将其与XbaⅠ和BamHⅠ双酶切的慢病毒载体pH IV-EGFP连接,转化感受态细胞DH5α,挑取阳性克隆提取质粒,测序鉴定。经293T细胞包装后,收集含病毒颗粒的上清液,体外转染人骨髓间充质干细胞,同时设立阴性对照组(p HIV-EGFP空载体)。荧光显微镜下观察转染是否成功,Real time PCR检测转染细胞Pax6基因的表达。结果与结论:(1)酶切电泳及基因测序证实携带Pax6基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重组载体;(2)转染人骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下可以发出绿色荧光,且荧光强度不随培养时间延长而衰退;(3)经Real time PCR检测,被转染细胞内有Pax6基因表达,表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,能够使外源基因整合到宿主细胞基因组中。展开更多
目的探究通过加入间充质干细胞产生的细胞外基质,从而改变肪来源干细胞的微环境后,使得脂肪来源干细胞增殖转化功能改善的核心分子和作用机制。方法采用生物信息学方法,从基因表达谱芯片数据库中获取12组供体的转录组信息,并分为4组:Ad ...目的探究通过加入间充质干细胞产生的细胞外基质,从而改变肪来源干细胞的微环境后,使得脂肪来源干细胞增殖转化功能改善的核心分子和作用机制。方法采用生物信息学方法,从基因表达谱芯片数据库中获取12组供体的转录组信息,并分为4组:Ad on NHDF组,记录在聚苯乙烯培养基中加入人新生儿真皮成纤维细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Bm组,记录在聚苯乙烯培养基加入骨髓来源间充质干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Ad组,记录在聚苯乙烯培养基加入脂肪来源干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on TCPS组,记录脂肪来源干细胞在单纯的聚苯乙烯培养基的转录组表达情况。采用京都基因与基因组百科全书、基因本体、基因集合富集分析等富集分析手段,并利用软件R、Perl、Cytoscape进行差异分析和数据可视化。结果每种间充质干细胞产生其特定的细胞外基质,但在加入不同的细胞外基质培养基培养后的脂肪来源干细胞,都共享部分差异表达的基因和蛋白,如编码胶原家族基因。通过进一步将共享差异基因和功能集团构建蛋白互作关系,最终确定出改变微环境后影响脂肪来源干细胞增殖分化的3个重要分子COL4A1、COL11A1、COL15A1,分子的低表达可能与细胞修复、核苷酸代谢、DNA复制和细胞周期等多种生物学反应和信号通路相关。结论加入间充质干细胞产生的细胞外基质培养基培养的脂肪来源干细胞,编码胶原的基因表达量显著下调,并通过多种途径参与脂肪来源干细胞的增殖分化。展开更多
文摘背景:Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因,获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务,也是干细胞替代治疗的研究基础。目的:构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP,体外转染人骨髓间充质干细胞,检测Pax6基因在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法:利用PCR法从人Pax6 cD NA基因克隆载体p GEM-PAX6上扩增Pax6目的片段,将其与XbaⅠ和BamHⅠ双酶切的慢病毒载体pH IV-EGFP连接,转化感受态细胞DH5α,挑取阳性克隆提取质粒,测序鉴定。经293T细胞包装后,收集含病毒颗粒的上清液,体外转染人骨髓间充质干细胞,同时设立阴性对照组(p HIV-EGFP空载体)。荧光显微镜下观察转染是否成功,Real time PCR检测转染细胞Pax6基因的表达。结果与结论:(1)酶切电泳及基因测序证实携带Pax6基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重组载体;(2)转染人骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下可以发出绿色荧光,且荧光强度不随培养时间延长而衰退;(3)经Real time PCR检测,被转染细胞内有Pax6基因表达,表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,能够使外源基因整合到宿主细胞基因组中。
文摘目的探究通过加入间充质干细胞产生的细胞外基质,从而改变肪来源干细胞的微环境后,使得脂肪来源干细胞增殖转化功能改善的核心分子和作用机制。方法采用生物信息学方法,从基因表达谱芯片数据库中获取12组供体的转录组信息,并分为4组:Ad on NHDF组,记录在聚苯乙烯培养基中加入人新生儿真皮成纤维细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Bm组,记录在聚苯乙烯培养基加入骨髓来源间充质干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Ad组,记录在聚苯乙烯培养基加入脂肪来源干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on TCPS组,记录脂肪来源干细胞在单纯的聚苯乙烯培养基的转录组表达情况。采用京都基因与基因组百科全书、基因本体、基因集合富集分析等富集分析手段,并利用软件R、Perl、Cytoscape进行差异分析和数据可视化。结果每种间充质干细胞产生其特定的细胞外基质,但在加入不同的细胞外基质培养基培养后的脂肪来源干细胞,都共享部分差异表达的基因和蛋白,如编码胶原家族基因。通过进一步将共享差异基因和功能集团构建蛋白互作关系,最终确定出改变微环境后影响脂肪来源干细胞增殖分化的3个重要分子COL4A1、COL11A1、COL15A1,分子的低表达可能与细胞修复、核苷酸代谢、DNA复制和细胞周期等多种生物学反应和信号通路相关。结论加入间充质干细胞产生的细胞外基质培养基培养的脂肪来源干细胞,编码胶原的基因表达量显著下调,并通过多种途径参与脂肪来源干细胞的增殖分化。
