人脂肪组织分离培养基质干细胞的方法及其表型鉴定

目的:分离培养人脂肪基质干细胞,鉴定其表型。方法:实验于2005-03/2005-12在华中科技大学同济医学院血研所实验室完成。脂肪组织取自华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科阑尾炎及腹股沟斜疝的14例手术患者,排除了冠心病、高血压病及糖尿病等。手术前均与本人谈话并征得其同意获取脂肪组织进行实验。分离人脂肪组织,胶原酶消化后制备细胞悬液并培养,消化传代以纯化细胞。传代的脂肪基质干细胞进行细胞生长曲线绘制,流式细胞术及免疫荧光法检测其表型。结果:14份标本均成功培养出脂肪基质干细胞并生长良好,平均传至20～25代。①原代细胞培养72h后可见细胞贴壁,5d后可见细胞呈纺锤形、多角形改变,9d后细胞生长明显增加,排列密集并呈涡旋状生长,随着培养时间的延长,梭形细胞逐渐占据优势。到第12天后可见细胞铺满瓶底80%。传代后细胞增殖速度明显加快,于第3天开始数量明显增多,五六天后细胞即已长满培养瓶底,融合成片状,细胞排列更加整齐有序。多次传代后细胞呈更均匀有序的分布。②脂肪基质干细胞倍增时间约为48h。③第5代的脂肪基质干细胞细胞表型,呈CD31-,CD34-,CD45-,HLA-DR-,CD29+,CD105+。④免疫荧光法鉴定脂肪基质干细胞表达CD13和CD44。结论:本实验成功从人脂肪组织中分离培养出基质干细胞,通过流式细胞术和免疫荧光检测,培养后的细胞表达CD13、CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。

脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化

目的:应用转化生长因子β1,体外诱导脂肪干细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2005-04/2006-06在华中科技大学同济医学院公卫实验室完成。①取大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离、培养脂肪干细胞,体外传代培养。②取第3代细胞通过转化生长因子β1、地塞米松和维生素C诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。③诱导后14d观察细胞形态变化,进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原的表达,采用Western-blot和反转录-聚合酶链反应检测诱导前后成软骨相关的Sox9,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞接种的最初几日,细胞呈圆形,1周后贴壁细胞呈长梭形,体积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14d后多数细胞呈平坦的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。②诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中。③免疫组织化学染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。④反转录-聚合酶链反应检测成软骨相关的Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。⑤Western-blot印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论:脂肪干细胞在特定培养液的诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的细胞来源。

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的:建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法,鉴定并分析其生物学特性。方法:实验于2005-06/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔,兔龄4个月,无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫,贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞,并进行体外培养,取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征,并绘制细胞生长曲线及倍增时间,同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色;用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果:①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态:原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长,生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形,群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点:兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性,而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期:流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29,CD44,CD90,CD105,CD166表达阳性,而CD31,CD34,CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示,G0/G1期占80.25%,G2/M期占6.03%,S期占13.72%。结论:本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定,增殖较快的特点。

脂肪干细胞对大鼠胰岛细胞脂性凋亡的保护作用

[目的]探讨脂肪干细胞（ADSCs）对棕榈酸（PA）诱导大鼠胰岛瘤细胞（INS-1）凋亡的保护作用。[方法]本实验分为三组。空白对照组：正常培养液＋INS-1单独培养（其上层只含培养基）；PA组：含0．5mmol／LPA的高脂培养液＋INS-1单独培养；INS-1＋ADSCs组：高脂培养液＋INS-1＋ADSCs共培养。各组在处理24h后检测各组细胞的存活率、胰岛细胞基础胰岛素分泌量（BIS）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量（GSIS）；采用RT-PCR检测胰岛细胞中Ins-1、Glut-2、Pdx-1表达量；采用Elisa检测各组IL-6、TNF—α、HGF、TIMP—1和TGF—β水平。[结果]PA组和PA＋ADSCs组细胞存活率均较对照组下降（P〈0．01），但PA＋ADSCs组细胞存活率明显大于PA组（P〈0．01）。与对照组相比，PA组和PA＋ADSCS组BIS增加（P〈0．01），而GSIS均减少（P〈0．01）；与PA组比较，PA＋ADSCs组细胞BIS差异无统计学意义（P〉0．05），而GSIS显著增加（P〈0．01）。和对照组相比，PA组和PA＋ADSCs组的Pdx-1、Ins-1、Glut-2mRNA水平均明显下降（P〈0．01）；和PA相比，PA＋ADSCs组细胞的Pdx-1和Glut-2mRNA水平明显上升（P〈0．01），而Ins-1mRNA水平比较差异无统计学意义（P〉0．05）。PA＋ADSCs组中IL-6、TNF-α、HGH、TIMP-1、TGF-β的含量均较其他两组明显升高。[结论]PA能诱导INS-1细胞凋亡并抑制Ins-1、Glut-2、Pdx-1的表达，而ADSCs可以通过旁分泌机制并上调Glut-2和Pdx-1的表达对胰岛细胞起到保护作用。

体外培养脂肪干细胞向心肌细胞诱导的实验研究

目的:研究诱导体外培养脂肪干细胞(ADSCs)向心肌细胞分化的方法。方法:培养原代脂肪干细胞经CD34、CD44、CD105抗体标记鉴定后,进行5-aza诱导培养。通过鉴定心肌细胞特异性抗原横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T检测细胞分化情况。结果:ADSCs高表达间充质干细胞特异抗原CD44、CD105,不表达CD34;表达HLA-I抗原,不表达HLA-抗原。经5-aza诱导后,细胞形态变为类似于心肌样细胞。免疫细胞化学检测横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性,流式细胞仪显示心肌细胞特异性抗原阳性细胞为94%。结论:脂肪干细胞具有向心肌细胞分化的可能,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景。

脂肪干细胞体外快速扩增实验研究

目的:探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增兔脂肪干细胞的方法。方法:比较应用微载体结合旋转生物反应器(RCSS)进行动态培养与平皿静态培养两种方法中,脂肪干细胞生长曲线、倍增时间和生长周期的情况。结果:实验组RCSS法培养中脂肪干细胞密度可达最初接种的19倍左右,而对照组平皿静态培养仅为6倍余。实验组倍增时间短于对照组,且细胞周期分析显示G2-M期+S期细胞比例高于对照组。结论:利用微载体细胞培养技术可快速地在体外扩增脂肪干细胞。

脂肪干细胞治疗面部老化的研究进展

脂肪干细胞（Adipose-derived stemcells,ADSCs）是一种来源广泛、含量丰富、分离简单的间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）,属于成体干细胞的一种,被认为是脂肪组织中具有干细胞特性的细胞群,具有多向分化的潜能[1]。AD-SCs经过一定的定向培养后,