巨噬细胞特异性敲除KLF2基因小鼠模型构建与鉴定

目的 建立巨噬细胞特异性敲除Kruppel样因子2(kruppel-like factor 2,KLF2)基因小鼠模型,探讨KLF2对巨噬细胞炎症反应的调控作用。方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLF2~(flox/+)小鼠。通过与Lyz2-Cre~(+/+)小鼠繁育得到目的基因型小鼠,通过基因型鉴定、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western Blot从DNA、RNA、蛋白水平验证KLF2敲除效率。分离培养小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs),检测脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症相关因子mRNA变化。结果 建立了KLF2~(flox/flox)/Lyz2-Cre~+基因型小鼠,即巨噬细胞特异性敲除KLF2基因。小鼠骨髓、BMDMs的KLF2 mRNA及蛋白水平显著低于对照组小鼠,而心脏、肝、肾组织中KLF2 mRNA表达较对照组小鼠无显著变化。两组小鼠的体重、进食、进水、形态无显著性差异。在LPS作用下,缺失KLF2的BMDMs炎症相关基因IL-6 mRNA表达水平较对照组显著下降,而IL-1、iNOS、CD86 mRNA表达水平较对照组显著升高。结论 本研究成功构建了巨噬细胞特异性敲除KLF2小鼠模型,为进一步研究巨噬细胞KLF2对临床炎症相关疾病的调控作用及机制奠定基础。

采用Cre-loxP技术构建肝脏特异性Trappc11基因敲除小鼠模型

目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(+/-))进行杂交,对其子代进行基因型鉴定。筛选出Trappc11^(flox/+)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,将其与Trappc11^(flox/flox)小鼠进一步杂交可获得Trappc11肝脏特异性敲除鼠。将3~4周龄的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)、Trappc11^(flox/+)-Alb-^(Cre+/-)和Trappc11^(flox/flox)-Alb-^(Cre-/-)小鼠各3只,提取各组织脏器中的DNA,检测Trappc11的敲除效率和特异性。然后,在mRNA和蛋白质水平进一步验证。于第4周开始监测摄食量和体重等指标。结果我们成功繁育出肝脏特异性Trappc11基因敲除鼠,敲除心、脾、肺、肾、胰腺、肌肉、脂肪和脑组织中该基因表达未受影响,mRNA水平敲除效率达85%以上且TRAPPC11蛋白水平下降。该敲除鼠目前生长状态良好,饮食饮水正常,可用于后期繁殖与机制研究。结论已经构建成功的Trappc11flox/flox-Alb-Cre+/-鼠将为探索Trappc11在肝脏中的生理病理作用提供在体模型。

脂肪组织特异性PU.1敲除小鼠的鉴定及其活体脂肪和肌肉含量分析

本研究运用基因工程和同源重组等技术,产生了脂肪组织特异性PU.1敲除小鼠(aP2-cre-PU.1fl/fl),并用PCR技术进行基因型判定。Western blot结果表明,与PU.1fl/fl小鼠相比,aP2-cre-PU.1fl/fl小鼠脂肪组织PU.1蛋白表达显著降低,达到敲除水平。在此基础上,对1~6月龄的PU.1fl/fl和aP2-cre-PU.1fl/fl小鼠体重和活体成分进行了分析。研究发现,aP2-cre-PU.1fl/fl小鼠在出生后第5和第6月龄体重显著高于PU.1fl/fl小鼠(P【0.05);6月龄时,肌肉量无显著差异,但aP2-cre-PU.1fl/fl小鼠脂肪量明显高于PU.1fl/fl小鼠(P【0.05)。结果提示,aP2-cre-PU.1fl/fl小鼠脂肪重量的增加是其体重增加的主要原因。脂肪组织特异性PU.1敲除小鼠的生产为深入研究PU.1基因在体调控脂肪生成的功能奠定了基础,也为探索PU.1基因控制家畜体脂沉积提供了理论依据。

泛素特异性蛋白酶42调节人脂肪干细胞成骨向分化

目的:探索泛素特异性蛋白酶42(ubiquitin-specific protease 42,USP42)在人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)体内外成骨向分化中的作用。方法:用慢病毒转染hASCs,构建敲低和过表达USP42的稳定转染细胞系,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量、茜素红S矿化结节染色及定量,检测实验组(敲低组和过表达组)及对照组在成骨诱导下hASCs成骨向分化能力的差异,通过定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测实验组及对照组成骨相关基因的表达水平,通过蛋白免疫印迹实验检测实验组及对照组成骨相关蛋白的表达水平,通过裸鼠异位成骨实验评价USP42在hASCs体内成骨向分化中的作用。结果:敲低组USP42的mRNA和蛋白表达显著低于对照组,过表达组显著高于对照组。成骨诱导7 d后,敲低组的ALP活性显著高于对照组,过表达组显著低于对照组;成骨诱导14 d后,敲低组茜素红S染色显著深于对照组,过表达组显著浅于对照组。qRT-PCR结果显示,成骨诱导14 d时,敲低组ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COLⅠ)的mRNA表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。蛋白免疫印迹实验结果显示,成骨诱导14 d时敲低组runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、OSX和COLⅠ蛋白表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。裸鼠皮下移植物苏木精-伊红染色结果显示,敲低组类骨组织百分比较对照组显著增高。结论:敲低USP42显著促进hASCs的体内外成骨向分化,过表达USP42显著抑制hASCs的体内成骨向分化,USP42可作为骨组织工程学潜在治疗靶点。

诱导型巨噬细胞特异性敲除GRK2基因小鼠模型的构建及应用

目的 建立诱导型巨噬细胞特异性敲除G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因(GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+))小鼠模型。方法 基于Cre/LoxP系统构建GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳鉴定GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠的基因型。二氧化碳法处死小鼠后,Western blot检测骨髓源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞(PMs)中GRK2表达。免疫荧光检测小鼠脑、心脏和脾脏巨噬细胞中GRK2表达。流式细胞术分析前列腺素E2(PGE2)诱导的PMs中M1/M2比例。结果 基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在355 bp处有一条条带且Cre扩增产物长度在355 bp处有一条条带的小鼠即为GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。Western blot结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠BMDMs和PMs中GRK2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠脑、心脏和脾脏中GRK2表达降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例变化差异无统计学意义。在PGE2(10μmol/L)刺激下,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例升高(P<0.01),且GRK2^(flox/flox)小鼠PMs中CD86/CD206比例高于GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠(P<0.01)。结论 该研究成功构建出GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠模型,且该小鼠可促进PGE2诱导的PMs向M2型巨噬细胞极化。

特异性敲除CD147基因抑制小鼠非酒精性脂肪性肝炎的机制研究

目的:研究特异性敲除小鼠CD147基因抑制其非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的可能作用机制。方法:选择8周龄小鼠24只,其中12只敲除CD147基因,另12只不敲除。将敲除CD147基因的12只小鼠分为两组,每组6只。其中1组小鼠采用蛋氨酸-胱氨酸缺乏饲料(MCD)喂养,简称A1组;另1组小鼠采用正常饲料喂养,简称A2组。12只非基因敲除小鼠也分为两组,每组6只。其中1组小鼠采用MCD喂养,简称B1组;另1组小鼠采用正常饲养喂养,简称B2组。两周后处死小鼠,测定其血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、NLR家族Prin域3(NLRP3),并检测B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax蛋白)等表达。观察小鼠肝细胞凋亡情况。结果:HE染色与油红O染色显示,A1、A2组小鼠在2周时肝细胞变性程度明显弱于B1、B2组,P<0.05;A1、A2组小鼠肝细胞凋亡数量明显少于B1、B2组,P<0.05;A1、A2组小鼠血清ALT、AST、Bax水平低于B1、B2组,P<0.05,而Bcl-2水平高于B1、B2组,P<0.05;A1、A2组小鼠IL-1β、IL-18、NLRP3水平均低于B1、B2组,P<0.05。A1、B1组小鼠血清ALT、AST、分别高于A2、B2组,但A1组小鼠ALT、AST则低于B1组。结论:特异性敲除小鼠CD147基因,可以减弱小鼠肝组织脂肪变性,减少肝细胞凋亡(下调促凋亡分子Bax水平,上调抗凋亡分子Bcl-2水平)、降低细胞因子IL-1β、IL-18以及炎性小体NLRP3的表达,从而达到抑制NASH的目的。

软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制和鉴定

构建了含有软骨组织特异性Ⅱ型胶原A1启动子和Cre重组酶基因的转基因载体pcol2A1 Cre。 32 3枚小鼠受精卵经显微注射引入转基因片段后 ,分别移植至 14只假孕母鼠的输卵管使其发育。共得到仔鼠 5 2只 ,PCR鉴定结果显示其中 10只小鼠基因组上有Cre基因的整合 ,整合率为 19 2 %。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配 ,以检测Cre酶介导的重组及其组织特异性。PCR结果表明 :col2A1 Cre转基因小鼠软骨组织中表达的Cre重组酶成功地介导了LoxP之间的重组。

嵌合基因δKρF在转基因小鼠内的组织特异性表达

本文报告了鸡δ晶体蛋白基因的启动子,被Friend脾病灶形成病毒(SFFV)的长末端重复顺序(LTR)取代后的嵌合基因δKpF在转基因小鼠内的表达特性。采用显微注射方法,将含有δKpF基因的重组质粒pδKpF DNA导入小鼠受精卵的雄原核,再将其植入假孕小鼠的输卵管内,经生长发育,产出小鼠35只。以DNA-DNA分子杂交分析,发现其中1只小鼠的基因组DNA中整合有所导入的δKpE基因。再以免疫酶标记方法检测,发现δKpF基因在转基因小鼠内能够表达,而且具有组织特异性。作者认为,与δ晶体蛋白基因组织特异性表达有关的调节顺序位于+677bp之后。这与Hayashi等(1985)以培养细胞研究的结论不一致。

脂肪组织特异性敲除rictor损害胰岛素调节的脂肪细胞和全身糖脂代谢

mTOR是一个重要的调节细胞生长与代谢的丝氨酸／苏氨酸激酶，mTOR有包括两个多蛋白复合体：mTORC1和mTORC2。两种复合体都可以通过经典的P13K途径介导胰岛素和生长因子在细胞内内的信号传导。Akt是一个重要的胰岛素调节脂肪组织、骨骼肌和肝脏的糖脂代谢的信号转导中介，Akt的完全激活有赖于第473位丝氨酸的磷酸化（由mTORC2介导）以及第308位酪氨酸的磷酸化（由PDKl介导）。近年来，脂肪组织越来越受到人们的关注，其不仅仅是作为一个能量储存器官，同时也作为一个重要的内分泌器官，可分泌多种物质，例如瘦素、脂连素和抵抗素等。但是，mTORC2对脂肪组织中糖脂代谢有何作用目前还不清楚。研究者建立了脂肪组织nctor（mTORC2的一个重要组成成分）特异性敲除的小鼠以用于实验，这种小鼠被称为FRic一小鼠。

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C对内毒素血症大鼠肝组织CD14表达的抑制作用

目的观察磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)对大鼠内毒素血症时肝组织中Kuffer细胞(KCs)的活性、CD14mRNA的表达和血浆细胞因子释放的作用。方法将Wistar大鼠90只,随机分为LPS组(静注LPS5mg/kg)、PI-PLC组(注LPS前30min注PI-PLC100U/kg)和生理盐水NS组。分别于注射前及注射后1、3、6和12h取材,每组每时相点6只,测定血浆内毒素(鲎试剂基质偶氮显色法)、LBP及TNF-α(均用ELISA法)和IL-6(放免法)的含量,用RT-PCR检测肝组织中CD14mRNA的表达,并观察其形态学变化。结果LPS组LBP、TNF-αI、L-6的含量和CD14mRNA的表达明显增加,并伴有KCs激活,数量增多,体积增大,吞噬功能增强,肝细胞出现变性和坏死等;而PI-PLC处理组所致的上述变化明显减轻。结论PI-PLC对内毒素所致肝组织内KCs的激活有一定抑制作用。

巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶基因的小鼠模型构建

目的:构建巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶(AMPK)基因的小鼠模型,并观察对血压的影响。方法:利用胚胎显微注射法构建AMPKα1基因第3外显子两端携带loxP位点的小鼠模型,和集落刺激因子1受体启动子诱导表达Cre酶的小鼠模型,交配繁育出巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型。鼠尾DNA做PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导敲除AMPK,Real-timePCR检测小鼠骨髓细胞AMPKRNA水平。检测Cre阴性小鼠注射与不注射他莫昔芬的血压差异,以及Cre阴性和阳性小鼠注射他莫昔芬5d后的血压差异。结果:鼠尾DNAPCR鉴定出AMPKα1loxP为纯合阳性、且Cre为阴性或阳性的小鼠。与Cre阴性小鼠相比,他莫昔芬显著降低了Cre阳性小鼠骨髓细胞AMPKmRNA[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657),P<0.017]。他莫昔芬对Cre阴性小鼠血压的影响不显著[收缩压(122.9±3.183)vs.(124±6.878)mmHg,1mmHg=0.133kPa,P=0.427],而AMPK敲除鼠血压显著低于对照组[收缩压(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg,P=0.037]。结论:成功构建巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型,证实敲除鼠血压降低。

Toll样受体4在大鼠胰腺组织特异性分布表达

目的探索Toll样受体4(TLR4)在大鼠胰腺组织的特异性分布表达。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组化SP方法 ,检测Wistar大鼠胰腺组织中TLR4mR NA及TLR4蛋白的分布表达。结果通过RT-PCR方法 (31个循环 ) ,从正常大鼠胰腺组织检测到549bp目的基因片段。免疫组化方法检测到大鼠胰腺内有TLR4表达 ,主要位于胰管上皮、血管、微血管内皮及胰岛组织 ,胰腺外分泌腺泡细胞未见TLR4表达。结论TLR4在大鼠正常胰腺组织内有分布表达 ,主要定位于上皮组织 (胰管上皮 )和内皮组织(动脉静脉及微血管内皮) ,提示大鼠胰腺内。

家猪长链非编码RNA的组织特异性表达及其对肉质的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一类无法编码蛋白且长度大于200 nt的RNA,lncRNA可参与生物体内多种调控与代谢过程,且在多种生物体内呈现出组织特异性的表达模式。然而,lncRNA在家猪Sus scrofa domestica体内的组织特异性表达模式和功能机制尚不明确。肌肉内脂肪(IMF)是影响猪肉品质的重要因素之一,IMF的沉积受多种机制的调控,而lncRNA对IMF的影响还有待深入研究。本研究利用GEO数据库中家猪RNA-seq数据,通过生物信息学方法共筛选23678个lncRNA,包括14309个新鉴定的lncRNA,其中1218个被鉴定为组织特异性lncRNA(TS lncRNA)。与mRNA相比,lncRNA具有长度较短、表达量更低和外显子数量更少等特点。通过顺式作用与反式作用分别预测了TS lncRNA的潜在作用位点,并通过GO和KEGG分析进行功能注释,发现TS lncRNA的功能总体上与其所属组织或器官的功能相关。此外,发现了潜在影响家猪IMF含量的lncRNA MSTRG.7256.5,并对其进行了RNA干扰与过表达实验,结果表明MSTRG.7256.5会影响PPARγ、SCD等PPAR通路相关的脂质调控基因的水平,并反向调控家猪的脂肪沉积。本研究为生猪养殖和肉类行业未来的研究提供了线索和参考。

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物。为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析。PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200bp的目的条带。这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cre重组酶转基因小鼠鉴别开来。

fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立

旨在构建一种筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的载体,将其转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定整合fat-1基因的转基因细胞系。首先将人工合成的fat-1基因连接至L28-Wnt10b载体(1种带有小鼠脂肪组织特异性启动子Fabp4的载体)上,构建成fat-1基因脂肪组织特异性表达载体L28-fat1;同时经多次克隆构建成1种筛选标记可全部去除的骨架载体MCS-3s-LoxP-RFP;然后,利用Hind III和Not I对上述2种载体进行双酶切,接着进行连接,构建出筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的表达载体。采用脂质体介导的方法转染山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选转基因细胞。酶切鉴定及PCR检测结果表明,成功构建了3s-LoxP-RFP-FABP4-fat1表达载体,并首次获得了脂肪组织特异性表达fat-1基因的山羊胎儿成纤维转基因细胞系,为将来通过体细胞核移植创制脂肪组织特异表达fat-1基因的优质肉用转基因山羊新材料奠定了基础。

Subfatin脂肪特异性敲除动物模型的建立及胰岛素敏感性评价

目的Subfatin（又名Metrnl）是近年来发现的一个新的脂肪因子,能够被机体内多种脂肪组织表达、分泌.它在皮下白色脂肪中高丰度的表达,提示Subfatin可能参与调节白色脂肪的生物学功能和能量代谢.方法通过Cre/LoxP重组酶系统特异性敲除脂肪组织Subfatin的表达,成功构建了Subfatin脂肪特异性敲除小鼠模型（Subfatin^-/-）.与对照野生型小鼠（WT）相比,Subfatin^-/-脂肪组织中Subfatin的表达下调了57%.对WT和Subfatin^-/-小鼠给予正常饮食（NCD）和高脂饮食（HFD）喂养,使用葡萄糖耐量实验（GTT）和胰岛素耐量实验（ITT）对小鼠的胰岛素敏感性进行评估.结果正常饮食和高脂饮食喂养的WT和Sub-fatin^-/-小鼠在体重、摄食量以及能量代谢水平上均没有显著性差异.在高脂饮食喂养情况下,Subfatin^-/-小鼠出现的胰岛素抵抗明显地强于WT小鼠,这种差异在正常饮食情况下没有被观察到.结论脂肪组织缺乏Subfatin加剧了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗.

髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建和表型初步分析

目的:构建髓系特异性Abro1(Abraxas brother 1)基因敲除小鼠,并初步分析其对小鼠造血系统及LPS诱导败血症的影响。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre/LoxP重组系统构建Abro1^(flox/+)小鼠,将Abro1^(flox/+)雌雄小鼠自交,子代得到Abro1^(flox/flox)基因型小鼠。Abro1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配,子代得到Abro1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Abro1^(flox/flox)交配,最终得到的Abro1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Abro1基因敲除小鼠,即MKO小鼠;Abro1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(−)小鼠作为野生型小鼠,即WT小鼠。提取WT和MKO小鼠尾基因组DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型。提取WT和MKO小鼠免疫细胞蛋白,Western blot检测ABRO1蛋白表达。流式细胞术分析小鼠骨髓和外周血免疫细胞组成,检测MKO小鼠对造血系统的影响。LPS处理WT和MKO小鼠3 h,检测血清中相关生化指标变化以及炎症因子分泌情况。结果:PCR和Western blot结果显示髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建成功。流式细胞术结果显示WT和MKO小鼠骨髓和外周血中髓系细胞(CD11b^(+)、CD11b^(+)Ly6G^(+)、CD11b^(+)Ly6C^(+))和淋巴细胞组成(CD3^(+)、B220^(+))无差异。LPS诱导败血症实验中,MKO小鼠相关生化指标和炎症因子水平均低于WT小鼠,表明MKO小鼠可抵抗LPS诱导的败血症。结论:成功构建ABRO1 MKO敲除小鼠,发现MKO小鼠造血系统正常,但可抵抗LPS诱导的败血症,ABRO1 MKO小鼠的建立为揭示ABRO1在免疫细胞亚群中的差异性调控机制提供了良好的动物模型。

E-box元件对大鼠γ-GCS催化亚单位基因调控作用的组织特异性研究

目的:探讨大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因启动子(-745～-705)区段E-box元件对其转录调控是否存在组织细胞差异性。方法:分别将GCLC5’端上游序列驱动的荧光素酶报道基因载体GCLC-Luc、E-box缺失的delE-box-GCLC-Luc及pGL3-enhancer空载体瞬时转染大鼠不同组织来源的细胞,测得荧光素酶活性;并经蛋白定量及pSV-β-半乳糖苷酶的活性测定,获得校正荧光素酶活性值,通过比较校正荧光素酶活性值差异间接判断E-box元件对GCLC转录活性的影响。结果:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1),转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较转染GCLC-Luc组明显升高(P<0.001),说明E-box能使其GCLC转录活性下调;在大鼠肾小球细胞HBZY-1,转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较GCLC-Luc组明显降低(P<0.02),提示E-box具有上调该细胞GCLC转录活性的作用;而在大鼠神经胶质瘤细胞C6和小肠隐窝上皮细胞IEC-6,组间差异无统计学意义(P>0.05),提示E-box对其GCLC转录活性无影响。结论:E-box元件能组织特异性的调控大鼠GCLC基因的转录,该元件可能是决定GCLC基因存在组织差异性表达的重要顺式作用元件。

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有角质细胞特异性角质素 5启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pK5 Cre hGH。以显微注射的方法将 4 2kb的转基因片段K5 Cre hGH引入小鼠基因组 ,共注射 72 0枚受精卵 ,其中 6 95枚移植至 2 9只假孕母鼠的输卵管中发育 ,获得子代小鼠 48只 ,经基因型鉴定有 12只小鼠在其基因组上整合有Cre基因 ,整合率为 2 5 %。将带有Cre重组酶基因的小鼠与基因组上携带loxP位点的Smad4条件基因打靶小鼠杂交以检测Cre重组酶组织特异性表达情况以及介导重组的功能。结果表明 ,K5 Cre转基因小鼠只在皮肤组织中表达Cre重组酶并能在体内成功地介导loxP位点的重组。