脂肪细胞定向和分化因子1(ADD1)基因的研究进展

脂肪细胞定向和分化因子1(ADD1)是重要的核转录因子。ADD1不但是脂肪分化过程中重要的转录因子,同时还可以调控与脂肪代谢相关酶基因的表达。在人类和老鼠的研究发现ADD1基因与肝脏、脾脏等非脂肪组织的脂肪沉积有明确的连锁关系。实验研究提示:ADD1基因可能是影响动物肉质性状和屠体性状的候选基因。

LIM矿化蛋白1/低氧诱导因子1α慢病毒载体转染脂肪源性干细胞的成骨分化

背景:LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α作为胞内蛋白,可分别从诱导成骨分化及促进血管再生两个方面促进成骨,联合二者高效诱导脂肪源性干细胞成骨分化具有重要的意义。目的:探讨慢病毒载体介导的LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染的脂肪源性干细胞成骨分化的情况。方法:应用反转录PCR技术克隆目的基因LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α片段,并分别克隆于慢病毒骨架质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg和p LVX-EF1α-IRES2-AcG FP1中,构建慢病毒载体主体质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-AcG FP-RHIF-1α,随即与辅助质粒和包装质粒共转染Lenti-X 293T细胞,包装慢病毒载体;采用组织块加酶消化法分离培养大鼠脂肪源性干细胞,使用流式细胞仪对其进行鉴定。分别在慢病毒转染脂肪源性干细胞3,7,14 d后,应用反转录PCR方法检测脂肪源性干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平的同时检测血管内皮生长因子的表达水平。结果与结论:pL VX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-Ac GFP-RHIF-1α可有效地转染入大鼠脂肪源性干细胞;反转录PCR结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白在LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染后第7天都开始明显过表达,并且可持续到14 d。说明LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染脂肪源性干细胞可提高其成骨活性。

PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用。方法体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（MDI）方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α（0.1、1.0、10.0μg/L）干预分化后的成熟脂肪细胞（第10天）,收集TNF-α刺激前（0 h）及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平。采用Excel软件进行统计学分析。结果1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高。PRNP基因表达水平除在诱导分化前（第-1天）至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外（Pa〉0.05）,其余各时段间表达水平均有显著性差异（Pa〈0.05）;2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α（0.1、1.0、10.0μg/L）均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性。结论PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性。

脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化

背景:大量研究表明多种组织来源的成体干细胞在体外均可向类髓核细胞分化。椎间盘髓核组织来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下能否向类髓核细胞分化?其分化能力与脂肪间充质干细胞相比是否有差异目前未见报道。目的:比较脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞诱导分化能力的差异。方法:分别取大鼠腹股沟处脂肪组织与尾段脊柱,采用机械酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞。流式细胞仪检测两种细胞CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24的表达。脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞各自分为诱导组、无因子诱导组和对照组,诱导组以转化生长因子β1标准软骨诱导液培养,无因子诱导组以不含转化生长因子β1的软骨诱导液培养,对照组以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。培养14 d后用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果与结论:两种细胞CD105、CD90、CD29表达阳性,CD45、CD44、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14 d后两种细胞诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因表达水平较对照组均明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);髓核间充质干细胞诱导组3种基因的表达水平明显高于脂肪间充质干细胞诱导组,差异有显著性意义(P<0.05)。提示脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞均具有向类髓核细胞分化的能力,而髓核间充质干细胞相对于脂肪间充质干细胞其软骨相关基因表达更高,可能更适合于作为组织工程髓核研究的种子细胞。

凋亡蛋白酶活化因子1基因在脂肪细胞诱导分化中表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的观察3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中（0～10d）凋亡蛋白酶活化因子1（APAF1）基因表达水平的变化趋势，探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成熟脂肪细胞中APAF1基因表达水平的调节作用。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞，通过油红O染色鉴定其分化成熟的基础上，应用人重组TNF-α．1．0ng·mL^-1干预分化成熟的脂肪细胞，抽提脂肪细胞总RNA和总蛋白后，采用RT-PCR及Westernblot技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间（2、6、12和24h）脂肪细胞中APAF1基因的表达水平。结果①3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中（0～10d），APAF1基因表达水平呈现逐渐减低的趋势；②人重组TNF-α对成熟脂肪细胞中APAF1基因的表达具有显著的增强作用，且TNF-α对APAF1基因表达的上调作用呈现随刺激时间延长而明显增强的总体趋势。结论①在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中，APAF1基因的表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚；②APAF1基因在人重组TNF-α刺激成熟脂肪细胞过程中呈明显上调趋势，这种上调可能具有协同TNF-α促进成熟脂肪细胞去分化的作用。

三磷腺苷合酶抑制因子1基因敲除对小鼠成纤维细胞中三磷腺苷水平及脂肪细胞分化的影响

目的探讨三磷腺苷合酶抑制因子1(ATPIF1)基因敲除对小鼠成纤维细胞中三磷腺苷(ATP)水平及脂肪细胞分化的影响。方法取5只ATPIF1基因敲除小鼠作为观察组,另取5只C57BL/6小鼠作为对照组。取各组小鼠耳组织,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶Ⅱ的消化作用制备成纤维细胞并用高糖培养基培养,传代1~2次后,待细胞长满且接触抑制3 d后,更换含白色脂肪细胞诱导剂Ⅰ的细胞培养基诱导4 d,再更换含白色脂肪细胞诱导剂Ⅱ的细胞培养基诱导4 d。在诱导前及诱导4、8 d分别采用ATP检测试剂盒和三酰甘油(TG)检测试剂盒检测成纤维细胞中ATP和TG水平。结果诱导前,对照组小鼠原代成纤维细胞中ATP水平明显低于观察组(P<0.05);诱导4、8 d,对照组与观察组小鼠原代成纤维细胞中ATP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。诱导4、8 d,对照组小鼠原代成纤维细胞中TG水平低于观察组(P<0.05)。结论 ATPIF1基因敲除可增加小鼠成纤维细胞中ATP水平,促进成纤维细胞向白色脂肪细胞分化,提高成熟白色脂肪细胞储存TG的能力。

PGC-1β和SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的相互作用

为研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1β(PGC-1β)与SREBP-1c在猪前体脂肪细胞分化过程中的表达规律及其相互作用,分析二者功能上的联系,采用Western印迹及细胞免疫荧光技术检测PGC-1β与SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的表达,shRNA干扰和免疫共沉淀技术分别探讨了PGC-1β对SREBP-1c的调节作用及2种蛋白质在体内的结合活性.结果显示,PGC-1β与SREBP-1c蛋白的表达均随猪脂肪细胞分化逐渐增加,且在分化细胞的核和胞浆中均有分布.干扰PGC-1β显著下调了SREBP-1c和脂肪细胞分化标记基因C/EBPα的表达(P<0.05),同时降低了细胞内甘油三酯的积累.免疫共沉淀证明,PGC-1β与SREBP-1c蛋白在猪脂肪细胞分化过程中存在结合作用.以上结果表明,PGC-1β能够促进猪脂肪细胞分化并对SREBP-1c有调节和结合作用,推测二者的结合可能与其对脂肪细胞的分化调节机制相关,将对PGC-1β调控脂肪细胞分化的功能和机理研究提供新途径.

TGF-β1基因转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的TGF-β1基因转染大鼠的ADSCs(adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;TGF-β1基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染TGF-β1的ADSCs在目的基因TGF-β1、SOX9、Aggrecan、Collagen II mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen II的分泌增强,明显高于对照组和转染空载体组;结果TGF-β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。

成纤维细胞生长因子1在促人脂肪细胞形成中抑制Wnt/β-catenin信号通路

目的:研究成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor-1,FGF-1)调控人脂肪细胞形成的时序性,明确其潜在的分子调控机制。方法:以过度生长综合征(Simpson-Golabi-Behmel syndrome,SGBS)患者前体脂肪细胞为模型,利用人重组蛋白FGF-1处理细胞,分别于细胞增殖期(D-3)、融合期(D0)、诱导分化前期(D3)、中期(D7)及成熟期(D14)收集细胞,通过油红O染色及油红O提取法观察细胞内脂滴聚集情况,运用实时定量PCR及Western印迹方法分析成脂相关基因及Wnt/β-catenin信号通路相关因子的时序表达情况。结果:与对照组相比,FGF-1显著增加了SGBS细胞的脂质聚集,持续促进过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferater-activated receptorγ,PPARγ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)、脂连蛋白(adiponectin)和葡萄糖转运体4(glucose transporter type 4,GLUT4)m RNA的高表达;同时,FGF-1显著下调Wnt/β-catenin信号通路相关因子β连环蛋白(β-catenin)和转录因子4(transcription factor 4,TCF4)的表达。结论:FGF-1促进SGBS脂肪形成的作用贯穿整个增殖及分化期,提示FGF-1促进脂肪形成的作用是通过调节Wnt/β-catenin信号通路来完成的。

IGF-1基因修饰诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因修饰对诱导脂肪干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的实验研究。方法收集大鼠收集其大网膜、肾周脂肪囊以及睾丸周边的脂肪组织,分离大鼠ADSCs后,采用免疫荧光检测所得细胞的表面抗原来鉴定细胞,同时将ADSCs体外培养,细胞实验分为正常组、对照组、实验组。将pcDNA3.1-IGF-1和pcDNA3.1-IGF-1-NC分别通过阳离子脂质介导法转染至实验组、对照组细胞,显微镜下观察各组细胞形态变化,依次使用茜素红、油红O、甲苯胺蓝染色、免疫荧光、蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测各组细胞向成骨、成脂、成软骨分化能力、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)的表达、ColⅠ、ColⅡ和IGF-1蛋白的表达水平。结果免疫荧光结果显示,提取细胞的抗原决定簇CD29、CD44呈阳性反应,CD14、CD34呈阴性,所提取细胞为大鼠ADSCs。正常组和对照组贴壁生长良好,形态清晰,细胞多为长梭形或角形。实验组细胞呈现旋涡状生长,细胞增殖较正常组快,细胞中央包体突起较多,有形成结节的趋势。与正常组相比,过表达IGF-1基因后,实验组细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力明显增强,ColⅠ、ColⅡ荧光强度明显增强,ColⅠ、ColⅡ和IGF-1蛋白表达水平明显升高,差异均具有统计意义(P<0.05),正常组细胞和对照组细胞相比,差异无统计意义(P>0.05)。结论IGF-1的基因修饰能明显促进大鼠脂肪充质干细胞向软骨细胞的分化。

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的 观察丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化，探讨TNF-α1对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用，分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖问的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞，在诱导其分化成熟的基础上，采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段（0～10d）脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平；应用重组TNF-α（0．1，1．0，10．0μg／L）干预分化成熟的脂肪细胞，采用RT-PCR技术检测1NF-α干预后不同时间（0．5，2，6，12，24h）脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果 1．3T3-L1前体脂肪细胞中，MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松（DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（MIX）、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟，MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2～5、d6～10时段内无显著性差异外（P均〉0．05），余各时段问表达水平均有显著差异（P均〈0．01）；2．不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞，均能显著上调MAPK8基因的表达，并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长，表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0．1μg／l，时，MAPK8基因的表达水平于干预12h时间点开始出现明显上调；浓度增加至1．0μg／L,时，MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2h时，但24h时间点的表达水平未见继续上调；TNF-α浓度为10．0μg／L时，除2h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外，12～24h时段的表达也呈上调趋势。结论 1．MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调，其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚，与肥胖发生有关；2．TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达，其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。

前脂肪细胞因子-1对糖脂代谢的影响

前脂肪细胞因子-1(preadipocyte factor1,Pref-1)是脂肪细胞分化早期具有分化抑制作用的分子标志,而脂肪细胞的分化障碍不仅能够导致脂代谢障碍,还可以使糖尿病的易患性增加,导致肥胖、脂肪营养不良、糖尿病等代谢性疾病。本文就Pref-1的结构、表达、其在脂肪细胞分化中的作用及其对糖、脂代谢的影响进行综述。

脂肪细胞定向和分化因子1基因的研究进展

脂肪细胞定向和分化因子1(ADD1)是1种重要的核转录因子,在脂肪细胞的分化过程中起着重要作用。文章介绍了ADD1基因的生物学特点,以及对畜禽ADD1基因的研究进展,为深入研究ADD1基因的功能提供参考。

抗小鼠移码因子1蛋白多抗制备及其在脂肪细胞分化中的表达

目的制备小鼠上游移码因子1(UPF1)蛋白多克隆抗体并探讨脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白的表达。方法构建UPF1蛋白表达载体,制备并纯化兔抗小鼠UPF1抗体;诱导3T3-L1细胞分化,并用免疫共沉淀(Co IP)方法观察脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白的表达。结果 1)制备了效价≥64万且与重组m UPF1蛋白和天然m UPF1蛋白均有很强的特异性结合能力的兔抗小鼠UPF1的多克隆抗体;2)小鼠3T3-L1细胞成脂诱导过程中UPF1蛋白表达量未发生明显变化;3)脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白与UPF2蛋白相互作用增加。结论 1)以m UPF1蛋白C端550个氨基酸为抗原制备的抗体能够有效识别m UPF1蛋白;2)在脂肪细胞分化过程中UPF1蛋白与UPF2蛋白互作增强。

ADD1基因PCR-SSCPs标记与猪肌内脂肪含量及背膘厚的关系

采用PCR SSCPs方法在苏太猪脂肪细胞定向分化因子 1(ADD1)基因第 347和 374位点发现单核苷酸多态性(SNP) ,分别为ADD1第 90和 99位氨基酸密码子的第 3位碱基 ,但这两个位点碱基的替换均没有引起氨基酸序列的变化。通过对 10 0头苏太猪肥育猪背最长肌中肌内脂肪含量的相关分析 ,发现杂合子AB肌内脂肪含量最高 ,极显著地高于AA纯合子 (P <0 0 1) ,BB纯合子肌内脂肪含量介于AB和AA之间 ,并有高于AA纯合子的趋势 (P =0 11)。各基因型间背膘厚没有显著差异。提示ADD1基因该位点上的PCR SSCPs可能作为选择肌内脂肪含量 。

ADD1基因多态性与乌金猪肌内脂肪含量的关系

利用PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)技术检测75头乌金猪和41头长白猪脂肪细胞定向和分化因子1(ADD1)基因第2外显子区的遗传变异,并用最小二乘法模型分析ADD1基因对乌金猪和长白猪肌内脂肪含量的遗传效应。结果表明:在所检测的样本中均在乌金猪和长白猪ADD1基因的第2外显子上发现多态性,有2个等位基因(A和B),2种基因型(AA和AB),缺少BB基因型。AA和AB基因型在乌金猪中的频率分别为0.240和0.760,在长白猪中的频率分别为0.634及0.366。两种猪的优势等位基因均为A,其基因频率在乌金猪和长白猪分别为0.620和0.820。通过对两种猪不同基因型与肌内脂肪含量的相关分析,发现ADD1基因多态性对乌金猪和长白猪肌内脂肪含量的影响显著,且AB>AA(P<0.05),可通过提高AB基因型的频率来增加肌内脂肪含量,达到改善猪肉品质的目的。

DHA对C2C12细胞成脂分化过程中相关基因表达的影响

采用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤联合诱导C2C12细胞分化为脂肪细胞,诱导分化后加入100 mmol/L二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)。DHA处理8 d后,收集细胞,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα和ADD1转录表达水平。结果表明,C2C12细胞成脂分化时添加DHA能显著上调PPARγ、C/EBPα和ADD1基因的表达,并且联合添加维生素E后效果更显著。

老年女性骨质疏松性椎体骨折患者血清ODF、Pref-1与骨密度的关系

目的 探究老年女性骨质疏松性椎体骨折(OVCF)患者血清破骨细胞分化因子(ODF)、前脂肪细胞因子(Pref-1)与骨密度的关系。方法 选择86例OVCF患者为OVCF组,同期在医院行体检的47例健康成年女性为对照组,比较两组血清ODF、Pref-1水平与骨密度;按骨密度将OVCF患者分为低骨量组、骨质疏松组、严重骨质疏松组,比较3组血清ODF、Pref-1水平;通过受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ODF、Pref-1水平预测OVCF患者降低程度的价值;通过Pearson相关性分析血清ODF、Pref-1水平与OVCF患者骨密度的相关性,通过Logistic模型分析OVCF患者骨密度的影响因素。结果 OVCF组血清ODF、Pref-1水平较对照组明显增加,腰椎正位及股骨骨密度较对照组明显减少(P<0.05)。骨质疏松组、严重骨质疏松组血清ODF、Pref-1水平较低骨量组明显增加(P<0.05);且严重骨质疏松组血清ODF、Pref-1水平较骨质疏松组明显增加(P<0.05)。血清ODF、Pref-1水平均与OVCF患者骨密度呈负相关(r=-0.347、-0.301,P=0.001、0.007)。血清ODF、Pref-1水平预测OVCF患者降低程度的曲线下面积(AUC)分别为0.754、0.729,敏感度分别为74.30%、75.70%,特异度分别为75.00%、68.70%。ODF、Pref-1均可作为影响OVCF患者骨密度的危险因素。结论 老年女性OVCF血清ODF、Pref-1水平均明显上调,其表达均与骨密度密切相关,在评估及预测OVCF患者骨量减少方面具有重要价值。

ADD1基因多态性位点与猪肌内脂肪含量、嫩度及背膘厚的关联性研究

将82头藏猪和84头其他品种猪屠宰后测定背膘厚,采集背部最长肌测定肌内脂肪含量和嫩度。采集血样提取DNA,利用PCR-RFLP分析ADD1基因的基因型,发现藏猪和其他猪种中均能检测到三种基因型AA、AB和BB。三种基因型的肌内脂肪含量和嫩度存在差异(P<0.05),而背膘厚不存在差异(P>0.05)。ADD1基因在藏猪和其他猪种中存在多态性位点,可以作为肌内脂肪选育的标记辅助选择位点。