利用脂肪脱细胞基质构建组织工程化脂肪的实验研究

目的探讨以人脂肪组织脱细胞基质(ACAM)作为支架材料构建组织工程化脂肪组织的可行性。方法取腹部取皮术后的剩余人脂肪组织,经反复冻融、有机溶剂抽提以及酶消化处理后得到ACAM;利用组织学染色以及扫描电镜观察材料的脱细胞效果及微观结构;取第3代脂肪来源基质细胞(ADSCs)使用荧光染料Di I标记,将其与ACAM进行复合培养,检测细胞相容性并将复合物移植于Wister大鼠背部皮下,通过大体和荧光显微镜观察、湿重测定、组织学检测和油红O染色定性判断体内成脂能力。结果制备的ACAM无细胞残留且保持较完整的细胞外基质成分,扫描电镜和大体观察具有疏松、多孔的结构特征;ADSCs与支架相容性良好,体内移植8周后,实验组和对照组都有新生脂肪组织形成,实验组移植物湿重大于对照组(P<0.01)。HE切片及油红O染色均证实为成熟脂肪组织,实验组Di I荧光标记呈阳性,证实为外源性ADSCs。结论人ACAM具有良好的组织相容性和可降解性,适于细胞增殖及分化;联合人ADSCs在体内能够成功构建成熟的脂肪组织,可作为一种理想的组织工程支架。

不同性状脂肪脱细胞基质的制备及研究进展

近年来,组织工程作为一种新兴的治疗手段在整形和修复重建中的应用越来越受到临床和基础研究的重视。然而,目前常见的支架存在可塑性低或生物相容性差等缺点,寻求一种理想的支架材料仍是目前研究的热点和难点。脂肪组织脱细胞外基质(Decellularized adipose tissue,DAT)是指脂肪组织通过一系列脱细胞处理后得到的无细胞提取物,可模拟天然脂肪细胞外基质的特性,具有良好的生物相容性及可调节性,有望作为新型的组织工程支架应用于整形和修复重建等领域。本文将从DAT的特点、不同性状脱细胞基质的制备方法及研究进展等方面进行综述。

脂肪脱细胞基质联合负压封闭引流对皮肤软组织创面愈合的影响

目的研究脂肪脱细胞基质(decellularized adipose tissue, DAT)联合负压封闭引流(vacuum sealing drainage, VSD对皮肤软组织创面愈合的影响。方法⑴制备DAT材料;⑵观察并检测DAT联合VSD对创面愈合的影响。巴马小型猪12只,每只小型猪背部制造4个直径4.0 cm的皮肤软组织创面,4个创面随机分组:DAT/VSD组(DAT联合VSD),DAT组(单用DAT),VSD组(单用VSD),空白对照CON组(无菌纱布换药)。创面建立当日及治疗后第7、10、14、17、21天,对创面拍照并测量剩余创面面积。治疗后第7、14、21天对创面组织取材行HE染色、v WF免疫组化染色、微血管计数,并通过荧光定量PCR检测血管化相关因子表达情况。结果制备出的DAT具备疏松多孔结构,脱细胞基本彻底。DAT/VSD组在治疗后第14、17、21天,剩余创面面积少于其他3组(P<0.05),愈合所需时间少于其他3组(P<0.01);在治疗后第14、21天,DAT/VSD组创面微血管计数高于其他3组(P<0.01);在治疗后第7、14天,DAT/VSD组创面血管化相关因子表达均高于其他3组(P<0.05)。结论 DAT联合VSD可通过增加创面血管化有效地促进皮肤软组织创面愈合,其效果优于单独应用DAT和或VSD。

脂肪脱细胞基质联合封闭式负压引流对猪创面炎症反应的影响研究

目的初步探讨脂肪脱细胞基质(decellularized adipose tissue,DAT)联合封闭式负压引流(vacuum sealing drainage,VSD)对猪创面炎症反应的影响。方法取自愿捐赠人脂肪组织,经反复冻融、胰蛋白酶消化及异丙醇萃取制备DAT。大体观察冻干前后DAT外观,HE染色观察其结构和脱细胞效果。取雄性巴马小型猪18只,于每只猪背部制备4个直径4 cm皮肤软组织创面,并随机分为4组;其中,DAT/VSD组创面DAT覆盖联合VSD治疗,DAT组创面单纯DAT覆盖,VSD组创面采用VSD治疗,对照组创面无菌纱布覆盖。治疗后第3、7、10、14天取创面组织,HE染色观察中性粒细胞浸润情况,实时荧光定量PCR检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及M1型、M2型巨噬细胞表型标记物诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶1(arginase 1,ARG-1)mRNA的表达情况,ELISA检测iNOS、ARG-1含量。结果大体及HE染色观察示DAT呈疏松多孔结构,未见细胞残留。动物实验组织学观察显示,治疗后第3天DAT/VSD组中性粒细胞计数低于对照组和DAT组(P<0.05),与VSD组比较差异无统计学意义(P>0.05);第7、10、14天,DAT/VSD组中性粒细胞计数明显低于其他组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测显示,治疗后第3、7、10、14天,DAT/VSD组创面组织IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS mRNA表达均低于其他组,而ARG-1 mRNA表达升高(P<0.05)。ELISA检测显示,DAT/VSD组治疗后第3、7、10、14天创面组织iNOS含量均低于其他组(P<0.05),ARG-1含量高于其他组(P<0.05)。结论DAT联合VSD治疗猪皮肤软组织创面,可以减少继发于炎症反应的组织损害,效果优于二者单独使用以及常规换药。

人脂肪脱细胞基质联合皮肤移植修复创面的动物实验

目的探讨人脂肪脱细胞基质(decellular adipose matrix, DAM)联合皮肤移植手术治疗猪全层皮肤缺损创面的效果。方法取健康中青年女性腹部、大腿部吸脂术后废弃的颗粒脂肪,提取DAM;在3头猪的背部建立全层皮肤缺损的创面,分成空白对照组和DAM实验组(A、B、C组),实验组分别采用1 mm、2 mm、3 mm的DAM联合自体皮肤移植对缺损创面行一期治疗。结果术后14 d移植皮片成活率:空白对照组(98.1±0.3)%,A组(96.5±1.1)%,B组(89.9±3.9)%,C组(45.3±5.5)%。术后28 d,A、B组创面平坦,颜色淡红或近似正常皮肤,表面光滑,外观平整,触之柔软,皮肤可捏起;而空白组、C组的创面表面皱缩不平,与基底粘连更明显,触之较韧、不易捏起。组织学显微镜观察见愈合创面皮肤结构完整,基质材料完全重塑,实验组Ⅰ型、Ⅲ型胶原的比值较低。结论 DAM联合自体皮肤移植一期手术可促进猪背部全层皮肤缺损创面的修复,且修复后的创面质地得到明显改善。

骨膜微环境下脂肪脱细胞基质再生和分化的研究

目的观察骨膜微环境下,脂肪脱细胞基质(DAM)在体内向成脂或成骨方向分化的情况。方法2020年6—12月,将人体吸脂术获取的脂肪组织在全军整形外科研究所制备为DAM,选取6只4~6周雄性SD大鼠,按照同等初始体积植入到大鼠顶骨骨膜下。术后84 d取材,通过大体观察、组织学染色、免疫荧光染色观察DAM支架材料成脂和成骨分化情况;非标记定量蛋白质谱检测DAM中成骨相关蛋白。结果大体观察显示,DAM支架材料周围血管化丰富。HE和Masson染色观察到DAM脂肪再生和血管化现象,同时OCN免疫荧光染色证实,DAM少部分向成骨方向分化。质谱筛选出了成骨分化相关蛋白。结论骨膜微环境下,DAM主要向脂肪组织方向分化,但少部分具有向成骨方向分化的潜能,可能与DAM中含有部分成骨相关蛋白有关。

脂肪组织来源的脱细胞基质生物水凝胶修复大鼠坐骨神经缺损

目的观察脂肪组织来源的脱细胞基质水凝胶(DAT-gel)对大鼠坐骨神经缺损的修复效果。方法2019年4月-2020年4月,收集在解放军总医院第一医学中心整形修复科行大腿或腹部吸脂术的健康成年女性的术后废弃无菌颗粒状脂肪组织,术前均获得患者知情同意。对脂肪组织行脱细胞和酶消化处理制备成DAT-gel。扫描电镜(SEM)观察水凝胶的超微结构,流变学测试水凝胶的凝胶动力学和粘弹性。建立大鼠坐骨神经缺损模型,并将其随机分为3组:单纯几丁质导管组(Chitin组)、DAT-gel加几丁质导管组(DAT-gel组)和自体神经反接组(Autograft组),每组10只动物。术后12周分别对再生神经的大体观、功能学以及形态学等一系列指标进行观察,评估损伤神经的修复情况。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行数据分析,如果组间差异有统计学意义,则进一步采用Turkey法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果SEM检查结果显示DAT-gel凝胶内部呈三维疏松多孔的纤维网络结构。流变学测试结果显示:水凝胶在4℃与37℃时复数粘度分别为148.91 mPa·s和801.29 mPa·s。DAT-gel随温度增高发生溶胶-凝胶相变结果显示DAT-gel具备良好温敏效应,其溶胶-凝胶相变临界点近似体内温度。动物实验结果显示,术后12周,DAT-gel组的再生神经形态及其功能均优于Chitin组(P<0.05)。结论DAT-gel可能对大鼠坐骨神经缺损的修复具有明显的促进作用。

脱细胞脂肪组织基质材料研究进展

细胞外基质在细胞增殖、分化及基因表达等方面发挥重要的调控作用,且与天然组织三维结构相似,被广泛应用于组织工程研究领域。脱细胞脂肪组织基质是脂肪来源的细胞外基质,其来源广泛、获取简单,且具有促脂肪新生和促血管新生作用,可为脂肪干细胞提供良好的微环境,为软组织缺损修复与重建带来了新思路。本文综述了脱细胞脂肪组织的制备方法、不同形式脱细胞脂肪组织基质作用及其应用。

脂肪组织脱细胞基质研究现状及展望

随着对细胞生物学和分子生物学研究的深入、学科间的交叉和相互渗透以及高新技术的推广应用,创伤修复与组织再生从基础理论研究到临床应用都获得了的令人振奋的成果,由细胞外基质组成的脱细胞组织已被临床用来支持组织和器官的再生。脂肪组织移植已成为整形外科及修复重建领域重要的手段广泛用于软组织缺损的修复和以美容为目的的软组织填充。来源于脂肪组织由细胞外基质组成的脱细胞基质已成为脂肪医学一个新的发展方向,展示出良好的应用前景。脂肪组织脱细胞基质的产生原因可以分为物理性、化学性、酶学以及多种方法的联合,不同的方法对脂肪组织清除细胞的效果不同,对细胞外基质的影响也不同,最终会使宿主对移植的脱细胞材料产生的反应不同,进而影响脱细胞产品的安全性和有效性。现就近年来脂肪组织脱细胞基质研究进展作一综述。

可注射人脱细胞脂肪组织基质匀浆的制备与应用

目的自主研发可控温高速软组织匀浆机将人脱细胞脂肪组织基质(DAT)制备成可注射匀浆,探讨其细胞相容性及填充效果。方法2019年3月至2021年3月,于解放军联勤保障部队第九四〇医院对正常脂肪组织进行脱细胞处理后得到DAT,将DAT与生理盐水按照1∶12混匀,用可控温高速软组织匀浆机以803×g匀浆,使制备DAT匀浆可顺利通过27 G针头。扫描电镜观察DAT匀浆并检测其细胞相容性;将脂肪颗粒、DAT匀浆、DAT匀浆+脂肪干细胞(ADSC)分别注射入大鼠背部,比较填充效果、血管生成能力、炎症浸润情况等。结果脂肪组织经脱细胞处理成功获得DAT,经可控温高速软组织匀浆机制备DAT匀浆,粒径(749.91±136.79)nm;细胞与其复合培养后,黏附率(92.16±1.00)%,CCK-8检测显示随时间延长,吸光度(A)值不断升高,细胞生长情况良好,匀浆对细胞无毒性。体内试验显示,DAT匀浆、DAT匀浆+ADSC填充效果明显好于脂肪颗粒组(P<0.01)。脂肪颗粒组有大量脂肪细胞坏死融合形成油囊,而DAT匀浆、DAT匀浆+ADSC未见明显降解,并有部分脂肪细胞生成。CD31染色结果显示,DAT匀浆组及DAT匀浆+ADSC组微血管数量高于脂肪颗粒组(P<0.01);CD68染色结果显示,DAT匀浆组及DAT匀浆+ADSC组炎症浸润低于脂肪颗粒组(P<0.01)。结论自主研发的可控温高速软组织匀浆机可将DAT制备为能通过27 G针头的DAT匀浆,具有较好的细胞相容性以及填充效果,且注射过程简单,创伤小,可作为填充材料。