家蚕脂肪酶1(Bmlipase-1)的原核表达和抗体制备及在转基因增量表达系统中的检测

家蚕肠液中的脂肪酶1(Bmlipase-1)对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)具有明显抑制作用,建立的增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕品系(LI-A)对BmNPV的抵抗力得到显著增强。为了分析LI-A品系幼虫肠液中Bmlipase-1的含量变化,通过原核表达、纯化Bmlipase-1蛋白,并免疫家兔制备Bmlipase-1的多克隆抗体,对LI-A品系和正常家蚕品种大造4龄、5龄起蚕肠液中的Bmlipase-1含量进行Western blotting检测。结果显示Bmlipase-1在LI-A品系幼虫肠液中的含量明显高于正常家蚕品种大造,证明LI-A品系对BmNPV的抵抗力提高是因为肠液中Bmlipase-1的含量增加。

牦牛肉品质相关的去饱和脂肪酶1基因表达差异分析

检测牦牛组织中去饱和脂肪酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)基因表达量,分别选择1月份、4月份、9月份年龄相近,取其肝脏、肾脏、结肠、背最长肌4个组织,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技术和酶联免疫反应测定牦牛不同组织中SCD1的表达量和含量。结果表明:以肝脏为对照组,SCD1基因在牦牛肝脏、肾脏、结肠、背最长肌4个组织中均有表达,且SCD1基因表达量和蛋白含量均在牦牛背最长肌中最高,差异显著(P<0.05)。不同月份间,1月份牦牛SCD1基因表达量和蛋白含量都低于9月份和4月份。说明SCD1基因在牦牛不同组织均有表达,且在寒冷季节表达量较低。

基于长链底物亲和的脂肪酶MAS1理性设计改造

探讨了脂肪酶MAS1对长链底物4-硝基苯酚豆蔻肉酸酯(pNP-C14)催化的最适温度、最适pH、pH稳定性,并通过分子动力学模拟计算得出结合自由能,然后根据结合自由能的差值初步筛选出了G145W及T141L两个单点突变体。实验表明,与野生型MAS1相比,结合自由能降低显著的突变体G145W的米氏常数(Km)减小了11%,催化常数(kcat)与Km的比值(kcat/Km)为野生型MAS1的1.29倍,突变体G145W对长链底物的亲和能力和催化效率均有提高;而结合自由能降低较小的突变体T141L的Km值增大了22%,kcat/Km为野生型MAS1的0.88倍,说明酶与底物分子结合自由能的降低并非准确的突变筛选标准。通过分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)残基拆解分析得出:残基T38、F39、L149、F153、V202、V233对脂肪酶活性口袋与长链底物结合的稳定性贡献较其他残基大;残基T38、G40、N41、N45和T237对提高长链底物的亲和能力具有重要贡献,预测为热点残基,其结合自由能的降低可以作为突变筛选的参考标准。

基于支持向量机的重组大肠杆菌产脂肪酶MAS1的发酵建模与优化

该研究以来源于海洋放线菌(Streptomyces sp.)W007脂肪酶MAS1为研究对象,将其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并优化了发酵条件。首先,通过单因素实验确定重组大肠杆菌表达脂肪酶的最佳诱导时间为对数生长后期,最佳异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.6 mmol/L,最佳诱导pH值为6.5,最佳诱导温度为20℃。然后,用R语言rsm包设计Box-Behnken试验,并在7 L发酵罐中进行发酵试验以得到Box-Behnken实验数据。最后,通过支持向量机(Support Vector Machines,SVM)-遗传算法(Genetic Algorithm,GA)计算得到重组大肠杆菌BL21(DE3)表达脂肪酶MAS1的最优发酵条件:IPTG浓度为0.65 mmol/L、诱导温度23℃、诱导pH值为6.7时,理论脂肪酶MAS1酶活力为2276.99 U/mL。在7 L发酵罐中,使用优化后的发酵条件进行重组大肠杆菌BL21(DE3)培养时,得到最大脂肪酶MAS1酶活力为2316.02 U/mL,比未优化之前(1733.33 U/mL)提高了33.61%。上述结果表明SVM-GA在重组大肠杆菌发酵条件优化方面具有较好的性能,为脂肪酶MAS1的高效制备提供了一定的研究依据。

牦牛去饱和脂肪酶1(SCD1)基因的克隆及分析

为了获得牦牛去饱和脂肪酶1基因全长序列,试验采用SMART的测序方法进行测序。结果表明:其作用于脂肪酸碳链Δ9位,使其变成双键,牦牛去饱和脂肪酶1基因序列全长为1 300 bp,开放阅读框(ORF)长1 080 bp,可以编码359个氨基酸,共含有20种氨基酸,其中亮氨酸含量最丰富,为11.7%,其次为苏氨酸7%,半胱氨酸含量最低为0.8%。起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,编码的成熟蛋白的分子质量为41 706.0 u,等电点为9.22。牦牛去饱和脂肪酶1基因序列已发表到Gen Bank(登录号为KC352711)上。

不同反应温度下T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应动力学研究

T1脂肪酶是一种新型耐热脂肪酶,能催化油酸与甘油的酯化反应。当甘油与油酸物质的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占总反应物质量)、缓冲液的添加量5%(占总反应物质量)和转速542r/min时,考察不同反应温度(40、50、60℃)下T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应的动力学。结果表明,T1脂肪酶催化该酯化反应活化能为20.272 9 k J/mol;当反应温度较低(40℃)时遵循准一级反应;随着反应温度升高到较高范围(50、60℃),则变为准二级反应。

T1脂肪酶催化合成甘油酯过程酯化率变化规律研究

采用自制新型T1脂肪酶在无溶剂中催化甘油与油酸合成甘油酯,考察了水添加量（4％～8％）、温度（40 ～70℃）和甘油/油酸物质的量比（2∶1 ～6∶1）对酯化反应的影响.基于反应条件,假设该酶促反应遵循一级反应,建立了酶促过程中油酸酯化率的动力学模型Er=CE＆#215;[1-e-k（t-t0）],通过规划求解得到了不同反应条件下的反应速率常数（k）、理论上平衡时最大酯化率（CE）和酶活性发挥所需的延迟时间to.不同反应条件对方程系数（k、CE、t0）的影响程度各不同,该结果为该酶催化过程优化控制提供了直接的数据支持;通过对比由动力学方程计算油酸酯化率的理论值与试验实测值,两者的相关系数达0.996,验证了该反应是符合一级反应,也反映了该酶催化合成甘油酯过程中反应速率常数及油酸酯化率的变化规律.

梳状聚苯乙烯环氧载体的制备及其对Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶的柔性固定化

以氯磺化交联聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-SO_2Cl)树脂为基质,依次与壳聚糖(Chi)和环氧氯丙烷(ECH)反应,制得了具有柔性链的梳状聚苯乙烯环氧载体PS-SO_2-Chi-ECH,研究了缚酸剂用量和种类、反应时间、反应温度及ECH用量对载体制备的影响。结果表明,较优的制备条件为:用Na_2CO_3作缚酸剂,壳聚糖树脂、Na_2CO_3和ECH的物质的量比1∶5∶5.0,反应时间2 h,反应温度50℃。将该聚苯乙烯环氧载体用于Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶的共价柔性固定化,固定化酶的热稳定性和贮藏稳定性均较游离酶明显提高。

盖子区域氨基酸的定点突变对T1脂肪酶酶学性质的影响

T1脂肪酶来源于Geobacillus zalihae菌株,常作为生物催化剂广泛应用于各领域。为了综合改善T1脂肪酶的酶学性质,前期通过对该酶盖子结构进行理性设计得到3个效果较好的突变体L188M、A190L、A190Y,在此基础上,将单点突变体进行组合得到L188M/A190L和L188M/A190Y两个复合突变体。在该实验中对突变体脂肪酶酶学性质展开研究,同时将单点与组合突变效果进行比较。结果显示野生型及突变体最适pH均为9.0,复合突变体的最适温度提高5℃。单点突变及组合突变均使T1脂肪酶的酶学性质得到不同程度的改善,且复合突变体效果更显著。组合突变体使脂肪酶的温度、pH稳定性显著提高,L188M/A190L对于有机溶剂二甲基亚砜及正十六烷的耐受性为野生型的1.88倍和2.73倍,L188M/A190Y为野生型的1.96倍和2.58倍。此外,对C16和C18底物的选择性也明显增强,L188M/A190L为野生型的1.65和2.7倍,L188M/A190Y为野生型的1.5倍和2.25倍。该研究成果在一定程度上拓宽了T1脂肪酶的应用前景,同时为其他脂肪酶的改造提供了一定理论依据。

家蚕胰脂肪酶相关蛋白1基因(BmPLRP1)的克隆及表达分析

胰脂肪酶相关蛋白1(Pancreatic lipase-related protein 1,PLRP1)是由PLRP1基因编码的一种脂肪酶,在通常状态下无活性。PLRP1的分泌与生物的生长发育有着密切的联系,但该基因在家蚕中的功能尚未清楚。本研究克隆获得家蚕PLRP1基因(BmPLRP1)的核苷酸序列,并对其序列特征进行生物信息学分析,进一步采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR检测BmPLRP1基因的表达水平。结果表明,该基因位于家蚕第12号染色体的nscaf2993位点,编码331个氨基酸,等电点为8.72,预测的BmPLRP1蛋白无信号肽、分子质量为37.1 kD,没有跨膜结构域,具有一个Pancreatlipaselike结构域,存在活性位点、磷酸化位点、O-糖基化位点,不存在N-糖基化位点。系统进化分析表明BmPLRP1与野桑蚕的PLRP1的进化关系较近;RT-PCR检测表明,BmPLRP1基因在家蚕5龄3天幼虫的头部、表皮、丝腺、生殖器、气管丛、中肠中有明显表达,而在血液和脂肪体中的表达量相对较低;对家蚕品种‘733xin’喂食经100 mg/kg NaF溶液浸泡过的桑叶后,实时定量PCR检测BmPLRP1基因在中肠、血液、丝腺、脂肪体中的相对表达量,结果表明均有所上调,推测该基因可能参与了氟化物侵染家蚕后的应答反应过程。

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。

7个家蚕新品系对BmNPV的抵抗力及中肠组织中Bmlipase-1的表达水平检测

为了获得对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染抵抗力较强的家蚕品系,以现行推广杂交组合粤蚕6号和两广二号的8个亲本品种为材料,给3龄起蚕添食浓度为4×107m L-1的Bm NPV多角体悬液,连续12代接种病毒筛选后获得7个对Bm NPV的抵抗能力有显著提高的新品系,其中新品系研7-N感染Bm NPV的发病率由原品种的96.30%降低至51.46%,表现出极显著差异(P<0.01)。采用荧光定量PCR方法,检测新品系及其杂交组合幼虫中肠组织中与Bm NPV抗性相关的脂肪酶1(Bmlipase-1)基因的表达水平,结果显示不同新品系间Bmlipase-1基因的表达水平差异较大,与其对Bm NPV的抵抗能力一致,其中春5-N、研7-N和湘晖-N等新品系及其杂交组合的Bmlipase-1表达水平均较原品种及其杂交组合极显著上升(P<0.01)。获得的家蚕新品系可作为抗Bm NPV育种的优良素材。

LPL、LMF1与重度高甘油三酯血症相关性及鱼油对其影响的分析

目的:研究脂蛋白脂肪酶(LPL)、脂肪酶成熟因子1(LMF1)与重度高甘油三酯血症(HTG)发生的相关性;观察高纯度鱼油治疗重度HTG效果,及其对LPL、LMF1的影响。方法:入选2020年9月-2021年10月就诊于包头医学院第一附属医院门诊甘油三酯(TG)≥5.65 mmol/L且<22.60 mmol/L的患者60例为重度HTG(SHTG)组,以TG<1.7 mmol/L的非HTG患者60例作为对照组。全部入选者用全自动生化分析仪检测血脂,用ELISA法检测血清中LPL和LMF1水平。其中SHTG组口服高纯度药用鱼油治疗3个月,3 g/d(早中晚各1 g),分别于用药前后空腹采集静脉血,用全自动生化分析仪检测血脂、肝肾功能,用ELISA法检测血清中LPL和LMF1水平。结果:SHTG组总胆固醇、极低密度脂蛋白(VLDL)均高于对照组(P<0.05),低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、LPL、LMF1均低于对照组(P<0.05),两组年龄、性别、体重指数及高血压病史比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。LPL、LMF1与TG呈负相关(P<0.05),LPL与LMF1呈正相关(P<0.05)。logistic回归分析结果显示,LPL为重度HTG的保护因素[OR=0.968,95%CI(0.941,0.996),P=0.026],LMF1非重度HTG的保护因素(P>0.05)。SHTG组鱼油治疗后LDL、LPL均升高、TG、VLDL均降低(P<0.05),HDL、LMF1干预前后比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:LPL是重度HTG的保护因素,LPL及LMF1降低与重度HTG的发生有关。鱼油可以有效降低重度HTG患者的TG、VLDL水平,升高LPL水平。

固定化T1酶合成聚酯增塑剂及其应用性能的研究

以三羟甲基丙烷(TMP)、二羟甲基丁酸(DMBA)和丁酸为原料,以固定化T1酶为催化剂,采用酯化缩聚法,优化酶法合成工艺,通过红外光谱和凝胶渗透色谱对聚酯产物进行了表征,并对聚酯增塑剂-聚氯乙烯(PVC)共混膜的增塑效率、热稳定性和迁移性进行了研究。结果表明,物质的量比为1∶9的TMP/DBMA酯化合成的聚酯产物,其玻璃化转变温度和断裂伸长率方面对PVC共混膜的增塑效率相当于邻苯二甲酸二辛酯(DOP)的72.84%和87.10%。与DOP-PVC共混膜相比,聚酯增塑剂-PVC共混膜具有更好的热稳定性,且其在乙醇和正己烷中的迁移率分别为DOP的47.53%和14.71%,综合展现出了良好的增塑性能和优异的耐迁移性。

抗小鼠PLRP1多克隆抗体的制备以及特异性鉴定和应用(英文)

小鼠胰泡细胞表达和分泌一种被称为胰甘油三脂酶(PTL)的脂肪酶,主要参与食物来源的甘油三脂的消化吸收,胰泡细胞同时也表达胰脂肪酶相关蛋白1(PLRP1),它同PTL具有很高的同源性.为了研究PLRP1的生物学功能,需要制备其抗体.应用谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达系统表达了GST融合蛋白,亲和纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗PLRP1的多克隆抗体.免疫印迹分析表明,该多克隆抗血清能检测出0.6ng的融合蛋白抗原以及在3μg的小鼠胰液提取物中检测出PLRP1蛋白.在证明抗体的特异性方面,尝试了一种新的方法:用PLRP1基因剔除的小鼠作为阴性对照,通过免疫印迹和免疫组化实验证明了该多克隆抗血清具有很高的特异性.进一步的研究发现,进食能促进胰腺中PLRP1的外分泌,这表明PLRP1可能在食物的消化过程中具有一定的生物学功能.

T1脂肪酶催化合成甘油酯过程中MAG与DAG最大含量预测模型研究

单甘酯（MAG）和甘油二酯（DAG）作为一类多功能添加剂，广泛应用于食品和化妆品等行业。本文利用T1脂肪酶催化甘油和油酸酯化反应合成甘油酯，探讨了底物摩尔比、水添加量、反应时间和温度对产物MAG和DAG含量的影响。结果表明，MAG含量随着反应时间的进行呈现先增大后缓恳减少的趋势，DAG含量则随着时间的进行先快速增大后趋于平衡的趋势，甘油三酯呈现不断增加的趋势。在给定温度范围内（40--60℃），温度对DAG和MAG含量影响可忽略不计。基于该过程摩尔比和水添加量的影响，建立了MAG和DAG含量变化规律的预测模型，ErDAG％=0．5967xr（-1．01Dw＋40．2），ErG％=0．7422xr00366×（-0．745D＋23．7），实验实测值与模型预测值之间相近程度的曲线拟合相关系数（R2）均达到0．99以上。可见，在本实验范围下，该模型可有效预测反应过程DAG和MAG最大含量的变化规律。本模型将为T】脂肪酶催化合成甘油酯过程中MAG和DAG最大含量变化的生产实践提供很好的指导。

固定化嗜热嗜碱土芽孢杆菌T1脂肪酶的制备及其催化特性研究

以葡聚糖填料作为载体,采用共价结合法对嗜热嗜碱土芽孢杆菌T1脂肪酶进行固定化,在获得固定化酶制备的最佳方案的基础上进一步考察固定化酶的催化特性。在单因素实验中,2-碘酰基苯甲酸终浓度1.23%、固定化温度50℃、固定化时间2 h的条件下效果最好,酶活力达到50.25 U/mg基质。利用该固定化酶催化橄榄油和甲醇进行醇解反应生成脂肪酸甲醇酯,60 h后得率为14.08%。同时,对固定化脂肪酶的热稳定性以及有机溶剂耐受性进行了研究,结果发现固定化T1脂肪酶在60℃孵育7 h后依然保持70%以上的酶活性;且除甲醇、乙醇外,固定化T1脂肪酶在经过正丁醇、正丙醇、异丙醇处理后酶活力能够增加到120%~140%。以上催化特性研究的结果表明,该固定化酶具有催化甲醇生成生物柴油的潜力,具有良好的热稳定性和有机溶剂耐受性,是一种具有良好工业应用前景的脂肪酶。。

解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrawia lipolytica)脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y.lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P.pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pG AP9K上,电转至P.pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵,以对硝基苯酚酯为底物检测脂肪酶水解活力,并对表达产物进行酶学性质分析。【结果】从Y.lipolytica中成功克隆了脂肪酶基因lip1(GenBank:Z50020),全长1461bp,编码486个氨基酸残基,无内含子,无信号肽;密码子优化后基因表达水平相对于出发基因有较大提高,且组成型表达优于诱导型;Lip1酶学性质分析表明,其最适底物为pNPB(C4),45℃下Tris-Hcl缓冲液pH8.5时最大水解酶活为8.07U/mL。【结论】Y.lipolytica脂肪酶基因lip1的克隆丰富了脂肪酶基因资源,其高效基因工程菌的构建为将来实现规模化生产奠定了技术基础。

表面活性剂对T1脂肪酶活力的影响

本文研究了非离子型、阳离子型、阴离子型以及两性离子型表面活性剂对T1脂肪酶活力的影响。采用不同浓度的表面活性剂对T1脂肪酶进行处理,再以对硝基苯酚月桂酸酯作为底物,测定处理后的酶活变化。研究发现,低浓度的非离子型表面活性剂对T1都有激活作用,使其相对酶活提高50%到150%。当非离子型表面活性剂的浓度超过其临界胶束浓度,T1的活力受到不同程度的抑制,其中吐温80的抑制作用最为明显。阳离子型(CTAB)、阴离子型(N-L与SDS)和两性离子型(SB3-14)表面活性剂都对脂肪酶的酶活有强烈的抑制作用,可能是因为离子型表面活性剂的带电基团与蛋白质表面的带电氨基酸产生强烈的电荷相斥作用,导致蛋白变性而失去活力。T1脂肪酶是一类具有工业应用价值的耐热脂肪酶,研究不同类型的表面活性剂对其活力的影响,对于在不同目的下选择使用适合的表面活性剂具有重要意义。