枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的生物信息学分析

该研究应用生物信息学方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA进行分析,旨在为LipA的后续研究奠定一定的理论基础。采用一系列在线网站或软件对LipA的一级结构、亲疏水性、基本特性、二级结构、特殊卷曲螺旋、模体以及富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的PEST序列等进行预测和分析,并对三级结构进行同源建模,对其表面电位、可及性分布以及Ramachandran图等进行分析。枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA是一种由212个氨基酸组成的稳定的脂溶性蛋白质,其亲、疏水性最强的区域分别为Lys75~Asn81和Val9~Leu17;不存在稳定的二聚体、三聚体卷曲螺旋和非PEST序列;有3种可能参与不同的生化反应的模体;有5段α-螺旋、6段β-折叠的α/β类蛋白;整体呈弱正电势;LipA的可及性和Ramachandran图表明建模得到的三维结构是合理、可靠的。该研究为后续对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的分子设计和改造提供了一定的理论基础。

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。

基于空腔填充效应构建伯克霍尔德菌脂肪酶LipA的热稳定性突变体

[目的]中温伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA在工业领域具有重要的应用价值。利用蛋白质工程技术来提高其热稳定性,对开发脂肪酶LipA酶制剂及提高其应用范围及应用效果,具有重要的意义。[方法]利用生物信息学软件Castp、Voronoia和Cave分析LipA分子中存在的空腔及其组成氨基酸残基;利用FoldX软件构建上述氨基酸残基的突变体电子文库,并基于空腔效应(体积变小)、自由能变化值(降低)和空间结构特点等对前述突变体电子文库进行筛选。从突变体电子文库中选择具有代表性的突变体,通过基因工程技术,引入突变。经诱导表达后,实验验证并筛选出热稳定性的突变体。[结果]构建了一个由58个突变体组成的电子文库;并对其中17个代表性的突变体进行了实验验证;筛选到2个热稳定性有明显提高的突变体LipA-His^15Pro和LipA-Ala^210Val;其叠加突变体LipA-His^15Pro/Ala^210Val的T50^12较野生型LipA提高了8℃,在55℃下的半衰期较野生型脂肪酶LipA提高了23.1倍。[结论]基于空腔填充技术构建热稳定性伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA突变体,是一种行之有效的策略。

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermids)是一种条件致病菌,SarA(StaphylococcalaccessoryregulatorA)是该菌中一个全局性调控因子,它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达.报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达.RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示,在表皮葡萄球菌ATCC35984中,SarA对atlE(自溶酶基因)表达起负调控作用,而对lipA(脂肪酶基因)和zinC(膜相关锌金属蛋白酶基因)的表达则有正调控作用.生物信息学分析表明,SarA控制atlE,lipA和zinC3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的,该DNA结合区保守并富含AT碱基.根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列,利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE,lipA和zinC的可能区域.基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子,结果提示,SarA能调控众多因子,可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.

二步法黑曲霉脂肪酶基因lipA的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的PCR引入碱基错配等问题,采用二步法(组装PCR和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipA。首先在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对lipA基因密码子及RNA二级结构进行优化并引入ClaI(237位)和PstI(475位)酶切位点;通过组装PCR分别合成lipA基因的各片段F1(237bp)、F2(238bp)和F3(422bp);通过该基因内的ClaI和PstI限制性酶切位点连接成完整的全长lipA基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对DNA合成的影响,提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipA-syn)在毕赤酵母GS115中经诱导表达72h后,发酵液酶活达176.0U/mL,蛋白质含量为143.7mg/L,较出发基因分别提高了10.8倍和5.6倍。实现了该基因的高效表达,并为产酶参数的优化和酶的规模化制备奠定了基础。

急性腮腺炎并发胰腺炎的血清学早期诊断指标

流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒感染引起的小儿常见的呼吸道传染病,其本身并非重症,但可引起脑膜炎、胰腺炎、睾丸炎、卵巢炎等,其中胰腺炎并发症是较为常见的一种,如不及时诊断,一旦发生,它将成为急性腮腺炎导致死亡的直接原因。

定点突变Ca^(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca^(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca^(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca^(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。