拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H2O2的长链脂肪醇氧化酶。在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因。然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知。本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringaepathovar(pv.)tomatostrain DC3000(PstDC3000)中的作用。拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜。与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H2O2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少。接种病原细菌PstDC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱。我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用。

水稻长链脂肪醇氧化酶基因OsFAO结构分析及其进化研究

我们通过多年来的研究已证实在高等植物中也存在编码类似于工业酵母中长链脂肪醇氧化酶(FAO)的基因。本文对单子叶植物水稻FAO基因的结构、起源和进化进行了分析。利用拟南芥中FAO蛋白的氨基酸序列对水稻基因组进行tblastn及blastp搜索,结果显示在水稻基因组中存在4个FAO基因,1个位于2号染色体,命名为OsFAO1;另外3个在10号染色体上,分别命名为OsFAO2、OsFAO3和OsFAO4。其中位于2号染色体上的OsFAO1基因由3个外显子和2个内含子组成;10号染色体上的3个FAO基因中,OsFAO3和OsFAO4为2个外显子和1个内含子组成,OsFAO2是由4个外显子和3个内含子组成。序列预测结果显示,OsFAO1编码跨膜蛋白的可能性更大。我们进一步对已知序列的各类原核(874种)和各类真核(包括20种真菌)的基因组进行了分析,发现FAO基因主要存在于真菌和陆生植物基因组中,而不存在于原核和藻类的基因组中。对陆生植物基因组中的FAO基因的分析结果表明水稻中OsFAO1基因序列相对原始。

脂肪醇氧化酶基因缺失对热带假丝酵母生理功能的影响

为考察热带假丝酵母(Candida tropicalis)脂肪醇氧化酶(FAO)基因缺失对菌株自身的影响,利用同源重组的方法敲除或回补FAO1和FAO2基因,研究突变株的生长情况和胞内脂肪醇氧化酶活性变化,并进一步评价细胞利用烷烃合成脂肪醇的能力。结果表明:成功构建了基因缺失突变株FTYT(ΔFAO11/ΔFAO12)、2aT2bT(ΔFAO2a/ΔFAO2b)、F3YT(ΔFAO11/ΔFAO12ΔFAO2a/ΔFAO2b)和基因回补菌株UCF1和UCF2。在以葡萄糖为碳源的培养基中,各菌株的生长情况没有显著差异;在以烷烃(C12~C14)为碳源的培养基中,FTYT菌株生长速度快于其他菌株,F3YT菌株的生长速度显著受到抑制,表明组合删除FAO1和FAO2基因降低了细胞对烷烃的利用,影响了细胞生长。与出发菌株相比,同时删除FAO1和FAO2基因后突变株能够转化烷烃合成正十二烷醇,摇瓶发酵水平达到59.63 mg/L,是出发菌株的近460倍。FAO1和FAO2基因在细胞利用烷烃中有重要作用且功能存在差异,并且可以作为代谢工程改造热带假丝酵母生产脂肪醇的潜在靶点。

含铁蛋白FAO1融合基因的衣藻核转化表达和分析

【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻(CW15)中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA,扩增片段与预期相符;转化衣藻FAO1蛋白纯化洗脱液使ABTS(2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐)底物反应变色。【结论】成功构建了信号肽、FAO1和His-tag融合基因的衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中,并成功转录,纯化的蛋白检测有活性。