脂肪间充质干细胞外泌体调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体平衡抑制心肌梗死后不良心室重塑

[目的]探讨脂肪间充质干细胞(ADMSC)外泌体(Exo)对心肌梗死(MI)后不良心室重塑的抑制作用和机制。[方法]观察心脏成纤维细胞经过氧化氢(H_(2)O_(2))处理后自噬和炎症表型的改变。MI大鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水、ADMSC外泌体(MSC-Exo)、成纤维细胞外泌体(MEF-Exo),观察心脏成纤维细胞自噬相关16样蛋白1(ATG16L1)、自噬相关蛋白7(ATG7)和NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达,炎症反应,心肌纤维化程度以及心功能。[结果]心脏成纤维细胞经H_(2)O_(2)处理后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著降低(P<0.001),NLRP3表达显著升高(P<0.001),促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平显著增加(P<0.001)。MI大鼠经MSC-Exo干预后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著上调(P<0.001),NLRP3表达显著下调(P<0.001),血清IL-1β和IL-18水平显著降低(P<0.001),纤维化相关蛋白胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ显著减少(P<0.001),心肌纤维化程度显著减轻(P<0.001),心功能明显改善(P<0.001)。[结论]脂肪MSC-Exo通过调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体的平衡,发挥抑制MI后不良心室重塑的作用。

脂肪间充质干细胞外泌体预防和治疗瘢痕疙瘩的研究进展

瘢痕疙瘩的发病机制复杂,受多种因素影响,如局部机械力、感染、激素水平、血压、缺氧、遗传及生活习惯等^([1]).瘢痕疙瘩较难自行消退,易复发,对患者的生理和心理健康产生一定的负面影响.近年来,外泌体成为干细胞治疗瘢痕疙瘩的替代方法^([2]).本文就脂肪间充质干细胞外泌体(Adipose derived stem cells-exosomes,ADSCs-EXOs)预防和治疗瘢痕疙瘩的研究进展进行了综述。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

脂肪间充质干细胞外泌体源非编码RNA在创面愈合中的作用

外泌体(exosomes,Exos)是脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)主动分泌的纳米大小的膜性囊泡,通过自身含有的生物活性分子如长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和环状RNA(circRNA)等非编码RNA(ncRNA)进入相应的靶细胞,参与细胞间通讯。脂肪间充质干细胞外泌体源非编码RNA(ADSC-Exo-ncRNA)可调控机体免疫和炎症反应、血管生成,加速皮肤细胞增殖和上皮化,调节胶原重塑,从而增强创面修复能力。因此,ADSC-ExoncRNA在创面修复过程中发挥重要作用,有望成为创面修复治疗的新策略。本文对近年来ADSCExo-ncRNA在创面愈合中的作用及其应用前景进行综述。

大鼠脂肪间充质干细胞及其外泌体的蛋白组学对比分析

背景:从蛋白组学方面分析脂肪间充质干细胞及其来源外泌体促进组织修复的研究较多,但缺少二者之间的蛋白组学对比分析。目的:对脂肪间充质干细胞及其外泌体进行蛋白组学分析。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,从细胞上清液中提取外泌体并进行鉴定;运用DIA蛋白组学分析大鼠脂肪间充质干细胞及其外泌体差异表达蛋白,对差异表达蛋白进行GO和KEGG分析。结果与结论:①脂肪间充质干细胞以长梭形为主,类似成纤维样;②经BCA法测定外泌体悬液的蛋白质量浓度为7.66 mg/mL;③外泌体呈典型的茶杯型,可见双层膜的囊泡结构,中央为低电子密度成分,外泌体粒径分布峰值为112.2 nm,浓度为7.5×10^(11)粒子/mL,平均直径在70-140 nm之间;④外泌体有表面标记蛋白CD9、TSG101高表达;⑤GO分析脂肪间充质干细胞及其外泌体的差异表达蛋白主要集中在细胞外基质和突触等位置,与离子结合和核糖体的结合能力相关,在细胞黏附和翻译过程中最为显著;⑥KEGG通路分析结果显示,差异表达蛋白主要参与细胞外基质受体交互、核糖体和细胞因子受体相互作用等,并且与胆固醇和甲状腺等多种代谢性疾病有关。

脂肪间充质干细胞外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs的保护作用

目的:通过体外建立大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)压力损伤模型,研究脂肪间充质干细胞(ADSCs)外泌体对损伤的RGCs的保护作用。方法:培养ADSCs收集上清提取并鉴定外泌体,将体外培养大鼠RGCs分为正常培养的RGCs对照组、不同压力(40、80、120 mmHg)培养的RGCs模型组、不同压力培养的RGCs加入外泌体治疗组,通过CCK-8法检测各组RGCs细胞增殖活力,qPCR法检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的mRNA表达水平,Western Blot检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的蛋白表达水平。结果:CCK-8法检测发现,在对照组中,与24 h的细胞增殖活力相比,48 h时细胞增殖活力上升(P<0.05)。在48 h时,与加压40、80、120 mmHg模型组相比,加入外泌体后细胞活力均上升(均P<0.05)。qPCR法检测发现,与对照组比较,40 mmHg组中BDNF mRNA表达下降,但无差异(P>0.05),80、120 mmHg组中BDNF mRNA表达下降(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达均上升(均P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达上升,但无差异(P>0.05)。与对照组比较,加压40 mmHg组中Caspase-3的mRNA表达上升,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中Caspase-3 mRNA表达均上升(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs的Caspase-3 mRNA表达下降(P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs Caspase-3的mRNA表达下降,但无差异(P>0.05)。Western Blot检测发现,与对照组比较,加压40 mmHg组中BDNF蛋白表达下降,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中BDNF蛋白表达下降(均P<0.001)。与模型组相比,加入外泌体治疗后BDNF蛋白表达均上升(均P<0.05)。与对照组比,加压后各模型组中Caspase-3蛋白表达均上升(均P<0.05);与模型组相比,加入外泌体治疗后各组Caspase-3蛋白表达均下降(均P<0.05)。结论:ADSCs来源的外泌体能够增加体外培养不同压力损伤的大鼠RGCs的细胞增殖活力,提高BDNF的mRNA及蛋白表达水平,降低Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平,说明ADSCs来源的外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs具有保护作用。

骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

背景:研究表明,抑制内质网应激所致的细胞凋亡能够挽救神经部分功能。茶多酚能抑制内质网应激,但是存在生物利用率差不易透血脑屏障等问题,结合外泌体靶向脊髓修复及高效载药,理论上两者结合能够发挥更优的脊髓保护效能。目的:探讨茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体对脊髓缺血再灌注损伤大鼠神经功能及内质网应激的影响。方法:SD雄性大鼠50只,随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组,每组10只,除假手术组外,其余4组制作脊髓缺血再灌注损伤模型,术后2 h经尾静脉注射生理盐水、外泌体、茶多酚、茶多酚+骨髓间充质干细胞外泌体混合液;脊髓损伤后7,14,28 d进行BBB神经功能评分,脊髓损伤后14 d,取脊髓组织进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、ATF6和GADD153内质网应激标志物免疫荧光染色。结果与结论:①神经功能评分:与假手术组比较,模型组、外泌体组、茶多酚组、联合治疗组神经功能评分均不同程度下降,术后14 d联合治疗组神经功能评分优于茶多酚组、外泌体组、模型组(P<0.05),术后28 d后联合治疗组神经功能评分优于模型组和茶多酚组(P<0.05);②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示:模型组大鼠神经元细胞数量减少,脊髓损伤区域内大量空洞坏死及瘢痕增生,茶多酚组、外泌体组、联合治疗组神经元数量和周边空洞坏死有不同程度改善,联合治疗组改善最为明显;③内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达:术后14 d联合治疗组GADD153表达低于模型组和茶多酚组(P<0.05),联合治疗组ATF6表达低于模型组、外泌体组和茶多酚组(P<0.05);④结果表明:茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体能改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达有关。

骨质疏松环境下骨髓间充质干细胞外泌体通过OPG/RANKL调控破骨分化

目的:绝经后骨质疏松PMOP(postmenopause osteoporosis)是一种慢性炎症性疾病,破骨细胞的异常活化是发病的重要原因之一。病理环境下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)外泌体对破骨细胞的作用及影响尚不明确。本研究分析了PMOP环境下,BMSCs外泌体(exosome,Exo)对破骨细胞分化的调控作用,对于明确骨质疏松的发病机制具有至关重要的意义。方法:分别从正常和绝经后骨质疏松患者骨髓中提取BMSCs,通过超速离心联合Exoquick试剂盒分别提取两种细胞的Exo,即正常BMSCs外泌体(healthyExo,H-Exo)和绝经后骨质疏松骨髓间充质干细胞外泌体(postmenopause osteoporosis-Exo,P-Exo),并通过透射电子显微镜(TEM),纳米颗粒示踪分析技术(NTA)、Western blot对分离的外泌体进行鉴定;两种不同的外泌体被引入RAW264.7细胞中,以便通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot分析和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来评估RAW264.7细胞中破骨分化相关指标的表达。同时,使用Western blot和ELISA方法来测定这两种外泌体中OPG/RANKL蛋白的表达水平。实验数据通过SPSS 24.0软件进行统计分析。结果:对提取后的两种外泌体进行形态学比较发现,与H-Exo相比,P-Exo直径更大,P-Exo能够促进RAW264.7细胞破骨分化标志性基因NFATC1和Trap mRNA及蛋白的表达,Trap染色可见分化的破骨细胞,Western blot及ELISA检测两种外泌体OPG/RANKL的表达发现,与H-Exo相比,P-Exo内OPG的表达量下降,而RANKL表达量升高。结论:绝经后骨质疏松中骨吸收增加,可能是炎症微环境下,BMSCs外泌体通过传递RANKL,促进破骨细胞分化引起的。此项研究为深入研究骨质疏松病因的开辟了新的途径,并为骨质疏松的治疗提供了新的治疗靶点。

间充质干细胞来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤形成的影响机制

目的 研究间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤(IA)形成的影响及机制。方法 原代分离大鼠骨髓MSCs(BMSCs)和脑血管平滑肌细胞(VSMCs)。将VSMCs分为PBS组、外泌体-miR-NC组(ExosomemiR-NC)、Exosome-miR-143组、Exosome-miR-143+GW4869组、过表达对照组(oeNC)、过表达KLF5组(oeKLF5)和oeKLF5+Exosome-miR-143组。超速离心法分离BMSCs来源的外泌体,并用透射电镜和纳米示踪分析鉴定外泌体。PKH26染色检测外泌体转移。miR-143 mimic和miR-NC转染BMSCs或VSMCs。实时荧光定量PCR检测miR-143和KLF5 mRNA的表达,Western blot检测相关蛋白的表达。CCK-8实验、EdU实验、流式细胞术实验、划痕实验和Transwell迁移实验检测VSMCs的活力、增殖、凋亡和迁移能力。双荧光素酶报告基因系统分析miR-143与KLF5的关系。构建大鼠IA模型,研究BMSCs来源的外泌体miR-143在体内对IA形成的影响。结果 与细胞裂解液组相比,miR-143在BMSCs外泌体中表达显著增加(P<0.01),且可通过外泌体转移到VSMCs中。与Exosome-miR-NC组相比,Exosome-miR-143组VSMCs的活力增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数显著减少(P<0.01);与Exosome-miR-143组相比,Exosome-miR-143+GW4869组细胞活力降低(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01)。与miR-NC或Control组相比,miR-143、Exosome-miR-143和ExosomemiR-NC组WT-KLF5的荧光素酶报告基因活性及KLF5的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),而MUT-KLF5的荧光素酶报告基因活性不变(P>0.05)。与oeNC组相比,oeKLF5组细胞活力显著降低(P<0.01),EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01);与oeKLF5组相比,oeKLF5+Exosome-miR-143组细胞活力明显增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显减少(P<0.01)。体内实验结果与细胞实验相一致。结论 BMSCs来源的外泌体miR-143通过靶向KLF5抑制大鼠IA的形成。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

脂肪间充质干细胞外泌体可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡

背景:间充质干细胞外泌体在组织损伤修复中可能发挥关键作用,而miRNA是外泌体发挥治疗作用的重要成分,其中miR-29b-3p具有减少细胞凋亡、促进轴突再生和血管生成的作用。目的:研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型的保护作用,并探讨相关机制。方法:①首先采用胶原酶消化法提取大鼠脂肪间充质干细胞,通过miR-29b-3p模拟物及抑制物转染脂肪间充质干细胞,采用超速离心法从培养上清中提取外泌体并进行鉴定,从而构建高表达和敲低miR-29b-3p的脂肪间充质干细胞外泌体;②通过过氧化氢诱导PC12细胞模拟神经细胞损伤模型,研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对神经元细胞损伤模型发挥保护作用的相关机制。结果与结论:①脂肪间充质干细胞外泌体具有典型的杯状形态,直径分布在50-140 nm范围内,表达外泌体表面特异性标志膜蛋白Alix、CD63及TSG101,并可被PC12细胞成功摄取;②脂肪间充质干细胞外泌体预处理可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡,并且这种保护作用随着外泌体中miR-29b-3p表达的增加而增强,随着外泌体中miR-29b-3p表达的降低而减弱,其发挥作用的机制与脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达及抑制凋亡蛋白Bax的表达相关。

脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制

背景:脂肪间充质干细胞可释放大量外泌体参与各种病理生理过程,关于脂肪间充质干细胞源性外泌体对肝星状细胞自噬的影响以及具体机制还有待于深入研究。目的:探讨脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p对肝星状细胞自噬的靶向调控作用及分子机制。方法:收集8周龄雄性C57BL/6小鼠腹股沟区脂肪组织,使用胶原酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,使用超速离心法提取脂肪间充质干细胞源性外泌体;取小鼠肝脏组织,使用胶原酶灌注消化法和密度梯度离心法分离提取肝星状细胞。实验分2组:对照组肝星状细胞常规培养48 h,外泌体组将肝星状细胞与脂肪间充质干细胞源性外泌体共培养48 h。通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光染色观察外泌体对肝星状细胞增殖活化、自噬及纤维化标志物表达的影响。RT-qPCR及Western blot检测外泌体对肝星状细胞中miR-15a-5p以及下游信号通路Bcl-2、Beclin-1和Rubicon mRNA和蛋白表达的影响。结果与结论:①与对照组相比,外泌体组肝星状细胞中自噬标志物LC3-Ⅱ表达下降,自噬小体数目显著减少,脂滴重新生成,细胞体积减小同时增殖能力减弱,肝星状细胞活化明显受到抑制;②与对照组相比,外泌体组肝星状细胞中α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达显著下降(P<0.01),miR-15a-5p表达显著增高(P<0.01),同时其下游靶基因Bcl-2表达显著下降(P<0.01),而自噬基因Beclin-1和Rubicon表达显著增高(P<0.01)。结果提示:脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p靶向抑制肝星状细胞中Bcl-2表达,促进其下游自噬基因Beclin-1、Rubicon表达,从而抑制肝星状细胞自噬。

脂肪间充质干细胞来源外泌体改善放射性口腔黏膜炎

背景:头颈肿瘤放疗极易引起放射性口腔黏膜炎,严重影响患者的健康及肿瘤的治疗计划。间充质干细胞在多种疾病中表现出治疗潜力,外泌体是其发挥功能的重要因素之一。目前尚无脂肪间充质干细胞来源外泌体应用于放射性口腔黏膜炎的相关研究。目的:探讨脂肪间充质干细胞来源外泌体在放射性口腔黏膜炎中的作用。方法:提取脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体并进行鉴定。通过3 Gy X射线辐射口腔黏膜上皮细胞诱导放射性口腔黏膜炎体外模型,在造模前给予脂肪间充质干细胞或脂肪间充质干细胞来源外泌体预处理48 h,EdU实验和克隆形成实验检测口腔黏膜上皮细胞的增殖能力。通过3 Gy X射线辐射构建放射性口腔黏膜炎小鼠模型,将脂肪间充质干细胞和脂肪间充质干细胞来源外泌体分别注入放射性口腔黏膜炎小鼠尾静脉,采用苏木精-伊红染色和免疫组化评估口腔黏膜上皮组织的炎症变化。结果与结论:(1)与对照组相比,脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体均可促进口腔黏膜上皮细胞克隆形成,增加口腔黏膜上皮细胞EdU阳性率;(2)脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体均能够缓解辐射处理小鼠口腔黏膜上皮组织的炎症;口腔黏膜上皮组织中CD45阳性细胞均减少,PCNA阳性细胞均增加。结果表明,脂肪间充质干细胞来源外泌体可促进口腔黏膜上皮细胞增殖,对放射性口腔黏膜炎小鼠口腔黏膜炎症具有缓解作用。

脂肪间充质干细胞外泌体在妇科疾病的应用及进展

随着干细胞研究的发展,脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cell,ADSC)和脂肪间充质干细胞外泌体(adipose derived mesenchymal stem cell exosome,ADSC-Exo)成为妇科领域的研究热点。ADSC是一类来源于脂肪组织的间充质干细胞,与其他间充质干细胞一样具有较高的增殖能力和多向分化潜能,ADSC-Exo还可通过释放的细胞外囊泡传递各种生物活性分子,如微小RNA、蛋白质和细胞因子,对目标细胞发挥一定的调节作用。ADSC-Exo在妇科领域的应用日益受到关注。有研究表明,ADSC-Exo可以促进子宫内膜的再生和修复,为宫腔粘连和不孕症的患者带来了希望。此外,一些研究提到ADSC-Exo在慢性子宫内膜炎、卵巢功能不全、多囊卵巢综合征和妇科恶性肿瘤等疾病的治疗中也具有一定的潜力。综述ADSC-Exo在妇科领域的应用及进展。

间充质干细胞外泌体对缺血性脑卒中大鼠神经功能恢复的影响

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSCs-EXO)对缺血性脑卒中大鼠神经功能恢复的影响。方法大鼠骨髓间充质干细胞原代培养,超速离心法提取其MSCs-EXO,大脑中动脉夹闭模型(MCAO)法制作大鼠缺血性脑卒中模型,MSCs-EXO经鼻给药,设为MSCs-EXO组,通过改良神经功能缺损评分(mNSS)和错步试验评估其神经功能恢复情况,并与未治疗模型组(MCAO组)做对比。PKH26标记MSCs-EXO并结合免疫荧光染色观察其在缺血半暗带(IP)中的分布,荧光定量PCR及Western blot检测IP区域脑组织中PTEN的表达水平,并与正常大鼠及MCAO组大鼠进行对比。结果MSCs-EXO治疗组的神经功能恢复高于MCAO组,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色显示标记外泌体可以进入IP区域神经细胞,荧光定量PCR及Western blot检测显示MSCs-EXO治疗组及MCAO组中PTEN水平均较正常升高,但MSCs-EXO治疗组的PTEN水平低于MCAO组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论MSCs-EXO能够促进缺血性脑卒中大鼠的神经功能恢复,这可能与其下调IP区域PTEN表达水平相关。

间充质干细胞来源的外泌体治疗早发性卵巢功能不全的研究进展

早发性卵巢功能不全(POI)是一种常见的妇科疾病,影响许多年轻女性的生活质量和生育能力。临床上常用的激素替代治疗只能暂缓POI患者的症状,无法修复受损的卵巢组织。最近的研究表明,间充质干细胞来源的外泌体在治疗POI中展现出巨大潜力。本文总结了人间充质干细胞来源的外泌体在治疗POI方面的研究进展,为未来在POI诊疗中应用外泌体提供实验基础和相关理论依据。

术后腹腔粘连形成机制及间充质干细胞外泌体的治疗前景

背景:术后腹腔粘连的形成是一个复杂的过程,预防术后粘连是临床上亟待解决的问题。目的:旨在从细胞及分子水平分析粘连的发生机制,为间充质干细胞外泌体预防和治疗粘连提供理论依据。方法:以“腹腔粘连,盆腔粘连,术后粘连,上皮间充质转化,间充质干细胞,干细胞外泌体,间充质干细胞外泌体”为中文检索词,以“Abdominal adhesion,pelvic adhesion,postoperative adhesion,epithelial mesenchymal transformation,mesenchymal stem cell,stem cell exosomes,mesenchymal stem cell exosomes”为英文检索词,检索PubMed、中国知网和中国生物医学文献数据库,筛选各数据库建库至2023年8月发表的术后腹腔粘连及间充质干细胞外泌体干预研究的相关文章,并进行系统的整理分析,最终纳入54篇文献进行综述。结果与结论:(1)任何腹膜炎症、机械损伤、组织缺血和异物植入等病理因素均可引起腹膜表面的损伤,引起术后腹腔粘连;腹腔粘连的形成过程包括腹膜间皮细胞修复、炎性反应、纤溶系统及凝血途径等过程的相互作用,涉及多种细胞因子及信号通路,包括Wnt/β-catenin通路能诱导纤维化和血管生成,并与转化生长因子β/Smads信号通路相互协同,能刺激成纤维细胞增殖,引起腹膜纤维化;同时,核转录因子kB信号通路上调细胞炎症因子的表达,促进成纤维细胞增生,组织纤维化的过程中发挥关键作用。(2)干细胞的旁分泌功能是目前以再生医学为基础的分子干预腹腔粘连的重要方向,可以参与作用于腹腔粘连中的多种复杂细胞因子及信号通路。(3)相对于传统治疗腹腔粘连的方法,间充质干细胞外泌体具有生物活性、使用安全、无需特殊培养和扩增、更低的免疫原性及较长的稳定性等优势,能通过多种途径引导一种正常的修复和愈合。(4)间充质干细胞外泌体在以往研究中均被证明可以参与调节粘连形成的上述各过程,在临床研究中显示出潜在的应用前景,但需要进一步临床研究以探索适当的间充质干细胞外泌体治疗方案,来解决临床转化的问题。

脐带间充质干细胞外泌体LncRNA H19修复软骨损伤的机制

背景:脐带间充质干细胞已被证明对软骨损伤有治疗作用,外泌体是脐带间充质干细胞在体内发挥治疗作用的主要载体。课题组前期发现LncRNA H19是介导脐带间充质干细胞外泌体调控软骨细胞活性的重要活性分子,LncRNA H19可以吸附miR-29b-3p从而促进软骨细胞的增殖再生,但是其下游机制仍未清楚。目的:从外泌体和LncRNAs角度揭示脐带间充质干细胞治疗软骨损伤的具体机制,为软骨损伤的治疗提供新的靶点。方法:构建稳定过表达LncRNA H19的脐带间充质干细胞,采用超速离心提取外泌体(H19-Exos);采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot和外泌体摄取实验鉴定外泌体;通过Western blot、qPCR和双荧光素酶报告基因系统检测miR-29b-3p过表达和沉默对TGF-β1/Smad3通路的影响;通过特异性TGF-β1/Smad3抑制剂在体内外反向验证H19-Exos对软骨再生的生物学作用。结果与结论:①H19-Exos在电镜下为典型的杯状,粒径在130 nm左右,均表达CD63、CD81和TSG1010特性蛋白;②过表达miR-29b-3p可以同时下调TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平,而沉默miR-29b-3p后,TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平上调;③双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-29b-3p对下游靶基因TGF-β1和Smad3活性影响有显著差异;④膝关节腔内注射Ⅱ型胶原酶成功建立大鼠骨关节炎模型,H19-Exos可显著促进软骨再生,且特异性TGF-β1/Smad3抑制剂SB-431542在体内外均可阻断H19-Exos对软骨再生的生物学作用;⑤该研究系统论证了高表达LncRNA H19脐带间充质干细胞来源外泌体对软骨再生的促进作用,具体机制为LncRNA H19通过靶向miR-29b-3p/TGF-β1/Smad3通路促进软骨再生。

人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

背景:研究发现,内皮素参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏,干细胞来源外泌体可降低血脊髓屏障的通透性,修复脊髓损伤。目的:观察人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过抑制内皮素1表达降低血脊髓屏障的通透性,进而修复脊髓损伤。方法:用超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中提取外泌体,透射电子显微镜观察其形态,Western blot检测tsg101、CD63的表达。80只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组(n=20),采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型,内皮素1组用微量注射器直接向损伤部位注射10μL(1μg/mL)内皮素1,术后即刻及1,2 d,分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200μL PBS,外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200μL外泌体(200μg/mL)。脊髓损伤后第1,3,7,14,21天进行后肢运功功能评分;损伤后第7天通过伊文思蓝染色观察血脊髓屏障通透性,Western blot检测脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin和内皮素1的表达。结果与结论:①外泌体组BBB评分在损伤后3-21 d显著高于模型组(P<0.05),苏木精-伊红染色显示外泌体组脊髓损伤较模型组明显减轻;内皮素1组BBB评分较外泌体组显著降低(P<0.05),内皮素1组脊髓损伤较外泌体组加重;②模型组内皮素1表达量较假手术组显著增加(P<0.05),外泌体组内皮素1表达量较模型组显著降低(P<0.05);③与模型组比较,外泌体组血脊髓屏障伊文思蓝渗出量显著减少(P<0.05),紧密连接蛋白β-Catenin、Occludin、ZO-1的表达增加(P<0.05);与外泌体组比较,内皮素1组伊文思蓝渗出量显著增加(P<0.05),上述紧密连接蛋白表达量显著减少(P<0.05);④结果表明,人脐带间充质细胞来源外泌体通过下调内皮素1表达来保护血脊髓屏障的通透性,起到了修复脊髓损伤的作用。

经血间充质干细胞外泌体对人卵巢癌细胞A2780生物学行为的影响

目的 探讨经血源性间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)来源的外泌体(MenSCs-derived exosomes,MenSCs-Exos)对人卵巢癌细胞A2780增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期分布的影响和机制。方法 分离纯化MenSCs,流式细胞术鉴定其细胞表型,油红O染色观察其成脂分化能力;超速离心法分离MenSCs-Exos,电子显微镜观察外泌体形态,纳米颗粒追踪分析其大小及分布,蛋白免疫印迹法检测外泌体标志性蛋白分子CD9、TSG101、calnexin的表达。采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell细胞体外侵袭实验、流式细胞仪检测MenSCs-Exos对A2780细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期分布的影响;蛋白免疫印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白和迁移相关蛋白的表达。结果 成功分离具有干细胞表型和成脂分化潜能的MenSCs,同时检测发现MenSCs-Exos为边缘清晰、大小分布均匀的膜性囊泡,粒径为30~150 nm,平均为72.89 nm,膜表面标志性蛋白CD9、TSG101表达呈阳性,calnexin表达呈阴性。与对照组相比,MenSCs-Exos能增强A2780细胞增殖、迁移和侵袭能力,影响其细胞周期分布,并且可上调β-catenin、c-Myc、TCF4、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin的表达,下调E-cadherin的表达。结论 MenSCs-Exos可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进A2780细胞增殖,并通过下调E-cadherin的表达促进A2780细胞的迁移和侵袭。