脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤

背景:富血小板纤维蛋白可促进软组织愈合,间充质干细胞分泌的可溶性因子具有促进皮肤再生的作用,两者联合应用促进皮肤损伤修复尚未见报道。目的:探讨脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白对小鼠皮肤创伤愈合的影响。方法:制作C57/BL6小鼠(西南医科大学实验动物中心提供)全层皮肤损伤模型,随机分为4组,每组10只。自造模后即开始治疗,各组分别涂抹脂肪间充质干细胞专用培养基、脂肪间充质干细胞条件培养液、富血小板纤维蛋白、脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白,3次/d,连续7d。在治疗后的1,3,7,10 d测量创面大小并计算治疗后3,7 d的创面愈合率;治疗后第14天进行创面愈合的组织学分析。结果与结论:(1)与脂肪间充质干细胞专用培养基组相比,其他3组创面愈合时间缩短;(2)治疗后3,7 d,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于其他3组,脂肪间充质干细胞条件培养液组和富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于脂肪间充质干细胞专用培养基组,差异有显著性意义(P <0.05);(3)组织学分析显示,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组小鼠创面白细胞及成纤维细胞聚集、血管新生、肉芽组织重塑、上皮化均比其他3组明显,伤口愈合效果最好;(4)结果表明,脂肪间充质干细胞条件培养液与富血小板纤维蛋白联合应用能有效促进小鼠皮肤损伤的修复,效果优于单独应用脂肪间充质干细胞条件培养液或富血小板纤维蛋白。

人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

背景:间充质干细胞可通过分泌含细胞因子、生长因子和外泌体的细胞外囊泡调节肿瘤微环境,对肿瘤细胞生物学行为进行精准调控。目的:研究人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过高速离心并过滤获得人脐带间充质干细胞条件培养基;收集人脐带间充质干细胞培养上清,通过超高速梯度离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体。使用PKH26标记人脐带间充质干细胞外泌体,与肝癌细胞MHCC97-H共培养,荧光显微镜观察MHCC97-H细胞摄取外泌体情况。通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验以及流式凋亡实验评估人脐带间充质干细胞条件培养基、人脐带间充质干细胞外泌体对肝癌细胞生物学功能的影响。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞外泌体可被MHCC97-H细胞摄取且主要分布于细胞质中;(2)人脐带间充质干细胞条件培养基处理后,MHCC97-H细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.05,P<0.01),凋亡能力显著下降(P<0.001);而人脐带间充质干细胞外泌体处理后,MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P<0.001),迁移、侵袭及凋亡能力显著增强(P<0.001);(3)结果表明,人脐带间充质干细胞条件培养基具有促进MHCC97-H细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡的能力;而人脐带间充质干细胞外泌体则具有促进MHCC97-H细胞迁移、侵袭及凋亡和抑制增殖的能力。

血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

背景:骨髓间充质干细胞是脂肪细胞的来源之一,且表达所有肾素血管紧张素系统成分,但血清血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪组织分化的影响尚不清楚。目的:观察血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的影响,并探究血管紧张素1a型受体敲除对血管紧张素Ⅱ影响骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的作用及可能机制。方法:分离培养野生型SD大鼠及血管紧张素1a型受体敲除SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将其培养至第3代,随机分为4组:野生组,基因敲除组,野生+血管紧张素Ⅱ组,基因敲除+血管紧张素Ⅱ组,在棕色脂肪诱导分化培养基中诱导分化14 d,后2组在每次更换分化培养基的同时加入100 nmol/L血管紧张素Ⅱ进行干预。采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法检测棕色脂肪诱导分化、脂肪分解、β氧化和线粒体生物发生等相关标记物的表达。结果与结论:血管紧张素Ⅱ可抑制骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化,敲除血管紧张素1a型受体基因能够通过促进脂肪分解、增强脂肪酸β氧化、促进线粒体生物发生、增强线粒体功能来改善血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的抑制作用。这些发现为肥胖治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点,揭示了肾素血管紧张素系统在脂肪代谢中的重要作用及其作为治疗目标的潜力。

急性髓系白血病细胞条件培养液对间充质干细胞的生物学影响

背景:目前,关于急性髓系白血病骨髓微环境中的骨髓间充质干细胞生物学功能及分子改变尚不完全清楚。目的:综合生物信息学和细胞实验探究急性髓系白血病患者来源骨髓间充质干细胞的生物学功能改变,并探讨急性髓系白血病细胞条件培养液在其中的作用。方法:从GEO数据集中筛选差异基因进行富集分析,并构建蛋白质互作网络和获取Hub基因。培养急性髓系白血病患者和健康供者的骨髓间充质干细胞,使用急性髓系白血病细胞条件培养液处理健康供者的骨髓间充质干细胞,对各组细胞进行成脂诱导分化、成骨诱导分化、β-半乳糖苷酶染色、细胞周期检测和Hub基因的验证。结果与结论:①从GSE84881中获取急性髓系白血病患者和健康供者的骨髓间充质干细胞基因表达数据,筛选出184个上调基因和140个下调基因。②富集的生物学功能主要包括细胞周期、脂肪细胞分化、细胞代谢过程和MYC通路。根据Degree算法筛选出上调的10个Hub基因和下调的10个Hub基因。③通过体外细胞实验发现,与健康供者的骨髓间充质干细胞相比,急性髓系白血病患者骨髓间充质干细胞表面抗原未发生改变,但其成脂分化能力增强、成骨分化能力减弱、β-半乳糖苷酶阳性细胞数增多、细胞形态改变、细胞周期停滞、LGALS3表达增加以及MYC表达降低。经急性髓系白血病细胞条件培养液培养后,健康供者骨髓间充质干细胞出现相似改变。④结果表明,急性髓系白血病患者骨髓微环境中的间充质干细胞生物学功能发生改变,这为骨髓间充质干细胞与肿瘤的交互作用提供新的见解。

大鼠脂肪间充质干细胞及其外泌体的蛋白组学对比分析

背景:从蛋白组学方面分析脂肪间充质干细胞及其来源外泌体促进组织修复的研究较多,但缺少二者之间的蛋白组学对比分析。目的:对脂肪间充质干细胞及其外泌体进行蛋白组学分析。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,从细胞上清液中提取外泌体并进行鉴定;运用DIA蛋白组学分析大鼠脂肪间充质干细胞及其外泌体差异表达蛋白,对差异表达蛋白进行GO和KEGG分析。结果与结论:①脂肪间充质干细胞以长梭形为主,类似成纤维样;②经BCA法测定外泌体悬液的蛋白质量浓度为7.66 mg/mL;③外泌体呈典型的茶杯型,可见双层膜的囊泡结构,中央为低电子密度成分,外泌体粒径分布峰值为112.2 nm,浓度为7.5×10^(11)粒子/mL,平均直径在70-140 nm之间;④外泌体有表面标记蛋白CD9、TSG101高表达;⑤GO分析脂肪间充质干细胞及其外泌体的差异表达蛋白主要集中在细胞外基质和突触等位置,与离子结合和核糖体的结合能力相关,在细胞黏附和翻译过程中最为显著;⑥KEGG通路分析结果显示,差异表达蛋白主要参与细胞外基质受体交互、核糖体和细胞因子受体相互作用等,并且与胆固醇和甲状腺等多种代谢性疾病有关。

脂肪间充质干细胞治疗急性肝损伤的分子机制

背景:急性肝损伤是由多种病因诱发的肝脏损害,如未及时治疗则会发展成急性肝衰竭,严重影响患者的生命安全。由于肝脏是人体最大的免疫器官和代谢器官,目前治疗急性肝损伤尚无最优方案。脂肪间充质干细胞因具有多向分化潜能和免疫调节活性已逐渐成为治疗急性肝损伤的有效工具。目的:综述目前脂肪间充质干细胞及其经不同方式修饰后治疗急性肝损伤的进展和分子机制。方法:从PubMed、Web of Science与中国知网数据库中检索2000-2023年发表的相关文献,以“Acute liver injury,liver injury,Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell,liver Injury Repair,stem cell transplantation,stem cell repair,Cell surface engineering,stem cell modification”为英文检索词,以“急性肝损伤,肝损伤,脂肪间充质干细胞,肝损伤修复,干细胞移植,干细胞修复,干细胞修饰”为中文检索词,最终检索筛选出该领域最新研究进展的62篇文献进行归纳分析。结果与结论:(1)脂肪间充质干细胞作为一种具有多向分化潜能的干细胞治疗急性肝损伤具有生物学优势,较其他两种主要间充质干细胞类型——骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞具有来源丰富、获取便捷、医学伦理问题少的特点,且较骨髓间充质干细胞的自我更新能力强。(2)脂肪间充质干细胞可以通过降低免疫反应、分化为肝细胞、分泌生长因子和外泌体等多种途径,降低血清炎症因子表达,减少肝脏组织炎性细胞浸润,抑制细胞焦亡和自噬,发挥抗凋亡作用,促进肝窦内皮细胞和肝细胞再生等分子机制改善肝损伤;目前尚无研究表明何种机制为脂肪间充质干细胞治疗急性肝损伤的最佳机制,多数观点认为这些分子机制之间相互影响相互作用协同发挥治疗作用。(3)生物材料修饰和药物预处理等方式可以提升脂肪间充质干细胞治疗急性肝损伤的疗效:一方面,生物材料和药物修饰可以提升脂肪间充质干细胞自身的功能,如提高增殖迁移能力,上调其分泌的生长因子水平,增强抗炎能力等,从而促进脂肪间充质干细胞在损伤部位存活;另一方面,生物材料和药物修饰可以抑制损伤部位炎性细胞活化,促进血管生长,改善损伤部位环境从而提高移植成功率。(4)总之,脂肪间充质干细胞可以通过分泌生长因子和外泌体、发挥免疫调节作用及促进肝脏再生等途径在治疗急性肝损伤中发挥重要作用。随着科学技术的发展,生物材料与药物修饰可以提升脂肪间充质干细胞的自我更新能力,改善急性肝损伤的局部微环境,为进一步促进脂肪间充质干细胞治疗急性肝损伤的临床应用提供新的思路。

脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制

背景:脂肪间充质干细胞可释放大量外泌体参与各种病理生理过程,关于脂肪间充质干细胞源性外泌体对肝星状细胞自噬的影响以及具体机制还有待于深入研究。目的:探讨脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p对肝星状细胞自噬的靶向调控作用及分子机制。方法:收集8周龄雄性C57BL/6小鼠腹股沟区脂肪组织,使用胶原酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,使用超速离心法提取脂肪间充质干细胞源性外泌体;取小鼠肝脏组织,使用胶原酶灌注消化法和密度梯度离心法分离提取肝星状细胞。实验分2组:对照组肝星状细胞常规培养48 h,外泌体组将肝星状细胞与脂肪间充质干细胞源性外泌体共培养48 h。通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光染色观察外泌体对肝星状细胞增殖活化、自噬及纤维化标志物表达的影响。RT-qPCR及Western blot检测外泌体对肝星状细胞中miR-15a-5p以及下游信号通路Bcl-2、Beclin-1和Rubicon mRNA和蛋白表达的影响。结果与结论:①与对照组相比,外泌体组肝星状细胞中自噬标志物LC3-Ⅱ表达下降,自噬小体数目显著减少,脂滴重新生成,细胞体积减小同时增殖能力减弱,肝星状细胞活化明显受到抑制;②与对照组相比,外泌体组肝星状细胞中α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达显著下降(P<0.01),miR-15a-5p表达显著增高(P<0.01),同时其下游靶基因Bcl-2表达显著下降(P<0.01),而自噬基因Beclin-1和Rubicon表达显著增高(P<0.01)。结果提示:脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p靶向抑制肝星状细胞中Bcl-2表达,促进其下游自噬基因Beclin-1、Rubicon表达,从而抑制肝星状细胞自噬。

脂肪间充质干细胞来源外泌体改善放射性口腔黏膜炎

背景:头颈肿瘤放疗极易引起放射性口腔黏膜炎,严重影响患者的健康及肿瘤的治疗计划。间充质干细胞在多种疾病中表现出治疗潜力,外泌体是其发挥功能的重要因素之一。目前尚无脂肪间充质干细胞来源外泌体应用于放射性口腔黏膜炎的相关研究。目的:探讨脂肪间充质干细胞来源外泌体在放射性口腔黏膜炎中的作用。方法:提取脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体并进行鉴定。通过3 Gy X射线辐射口腔黏膜上皮细胞诱导放射性口腔黏膜炎体外模型,在造模前给予脂肪间充质干细胞或脂肪间充质干细胞来源外泌体预处理48 h,EdU实验和克隆形成实验检测口腔黏膜上皮细胞的增殖能力。通过3 Gy X射线辐射构建放射性口腔黏膜炎小鼠模型,将脂肪间充质干细胞和脂肪间充质干细胞来源外泌体分别注入放射性口腔黏膜炎小鼠尾静脉,采用苏木精-伊红染色和免疫组化评估口腔黏膜上皮组织的炎症变化。结果与结论:(1)与对照组相比,脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体均可促进口腔黏膜上皮细胞克隆形成,增加口腔黏膜上皮细胞EdU阳性率;(2)脂肪间充质干细胞及脂肪间充质干细胞来源外泌体均能够缓解辐射处理小鼠口腔黏膜上皮组织的炎症;口腔黏膜上皮组织中CD45阳性细胞均减少,PCNA阳性细胞均增加。结果表明,脂肪间充质干细胞来源外泌体可促进口腔黏膜上皮细胞增殖,对放射性口腔黏膜炎小鼠口腔黏膜炎症具有缓解作用。

脂肪间充质干细胞条件培养液和二甲双胍对衰老皮肤成纤维细胞的作用

目的探讨脂肪间充质干细胞条件培养液、二甲双胍对衰老皮肤成纤维细胞的作用效果,并研究两者的作用机制。方法制备ADSC-CM、含2 mmol/L二甲双胍无血清培养基(Met)、ADSC-CM+2 mmol/L二甲双胍(ADSC-CM+Met),添加到衰老皮肤成纤维细胞中,在培养72 h后,使用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞活力,β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老率,超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞SOD活性以及qPCR检测COL1、ELASTIN、MMP-1、KLOTHO、NF-κB、GSH-PX基因表达量。结果①ADSC-CM组的细胞形态呈长梭形,轮廓清晰,折光性好,其他两组的细胞形态折光性较差;②ADSC-CM、Met、ADSC-CM+Met三组均能提高皮肤成纤维细胞活力,降低SA-β-gal染色率,且ADSC-CM组的作用最好;③三组实验组均能提高COL1基因表达,抑制MMP-1表达,但Met组的ELASTIN基因表达与对照组无差异性,其他两组均显著高于对照组;④KLOTHO基因表达,ADSC-CM和Met组均高于对照组,三组实验组的SOD活性也显著高于对照组,但谷胱甘肽氧化酶GSH-PX基因表达,只有ADSC-CM组显著高于对照组,其他两组显著低于对照组,Met组NF-κB基因表达与对照组差异无显著性,其他两组均显著性降低。结论脂肪间充质干细胞条件培养液、二甲双胍能提高皮肤成纤维细胞活性,延缓其衰老,且两者的作用效果有差异,这可能与作用机制相关,但可以确定的是,两者共同添加会产生拮抗作用。

牙囊细胞条件培养液在大鼠脂肪间充质干细胞向成牙骨质分化中的作用

目的:探讨牙囊细胞条件培养液(DFCCM)在诱导大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)向成牙骨质样细胞分化中的作用。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、牙囊细胞,制备DFCCM。用DFCCM诱导ADSCs,通过MTT检测ADSCs增殖能力的变化;免疫荧光及实时定量PCR方法检测成骨关键蛋白-骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)及成牙骨质关键蛋白-牙骨质附着蛋白(CAP),牙骨质蛋白(CP23)的情况。结果:牙囊细胞条件培养液诱导ADSCs后可抑制ADSCs的增殖能力。DFCCM诱导7d后,ADSCs细胞浆内表达OCN及CAP。同时DFCCM诱导ADSCs后CAP,CP23,ALP及OCN mRNA表达水平显著高于对照组。结论:牙囊细胞条件培养液构建的微环境可使ADSCs向成牙骨质样细胞分化,为干细胞介导的牙骨质再生提供新的思路。

脂肪间充质干细胞外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs的保护作用

目的:通过体外建立大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)压力损伤模型,研究脂肪间充质干细胞(ADSCs)外泌体对损伤的RGCs的保护作用。方法:培养ADSCs收集上清提取并鉴定外泌体,将体外培养大鼠RGCs分为正常培养的RGCs对照组、不同压力(40、80、120 mmHg)培养的RGCs模型组、不同压力培养的RGCs加入外泌体治疗组,通过CCK-8法检测各组RGCs细胞增殖活力,qPCR法检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的mRNA表达水平,Western Blot检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的蛋白表达水平。结果:CCK-8法检测发现,在对照组中,与24 h的细胞增殖活力相比,48 h时细胞增殖活力上升(P<0.05)。在48 h时,与加压40、80、120 mmHg模型组相比,加入外泌体后细胞活力均上升(均P<0.05)。qPCR法检测发现,与对照组比较,40 mmHg组中BDNF mRNA表达下降,但无差异(P>0.05),80、120 mmHg组中BDNF mRNA表达下降(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达均上升(均P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达上升,但无差异(P>0.05)。与对照组比较,加压40 mmHg组中Caspase-3的mRNA表达上升,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中Caspase-3 mRNA表达均上升(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs的Caspase-3 mRNA表达下降(P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs Caspase-3的mRNA表达下降,但无差异(P>0.05)。Western Blot检测发现,与对照组比较,加压40 mmHg组中BDNF蛋白表达下降,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中BDNF蛋白表达下降(均P<0.001)。与模型组相比,加入外泌体治疗后BDNF蛋白表达均上升(均P<0.05)。与对照组比,加压后各模型组中Caspase-3蛋白表达均上升(均P<0.05);与模型组相比,加入外泌体治疗后各组Caspase-3蛋白表达均下降(均P<0.05)。结论:ADSCs来源的外泌体能够增加体外培养不同压力损伤的大鼠RGCs的细胞增殖活力,提高BDNF的mRNA及蛋白表达水平,降低Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平,说明ADSCs来源的外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs具有保护作用。

年轻化间充质干细胞条件培养基促进小鼠创面愈合的研究

背景间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)条件培养基无细胞疗法是创伤修复领域的一种新型治疗方案,但其治疗效果受间充质干细胞状态的影响。目的探究年轻化MSC培养基对小鼠创面愈合的作用。方法建立间充质干细胞复制性衰老(传代至15~20代)模型,检测其衰老指征;使用小分子化合物[丙戊酸(valproic acid,VPA)和RepSox]逆转衰老间充质干细胞并验证逆衰老效果。分别收集衰老MSC培养基与年轻化MSC培养基。用收集到的两种条件培养基培养人成纤维细胞,使用CCK-8实验、Ki-67免疫荧光、划痕实验和Transwell实验检测这两种条件培养基对成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。分别用衰老MSC培养基、年轻化MSC培养基和0.9%氯化钠注射液治疗C57BL/6小鼠背部皮肤全层缺损模型,评估3种治疗方法对创面愈合的影响。结果与衰老的间充质干细胞相比,经小分子处理后衰老间充质干细胞SA-β-gal阳性率降低(P<0.01),且免疫荧光检测显示其衰老基因P21、P16表达降低(P<0.01)。经年轻化MSC培养基处理的成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力增强(P<0.01)。创伤模型显示,与对照组相比,年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面愈合速度加快(P<0.01);年轻化MSC培养基治疗组小鼠创面HE染色显示表皮细胞再上皮化加快(P<0.01)、Masson染色显示创面胶原沉积量增加(P<0.01)、CD31免疫荧光染色显示创面血管量增加(P<0.01)。结论年轻化MSC培养基对小鼠创面修复或有促进作用。

骨髓间充质干细胞条件培养基治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效及机制

目的探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell-conditioned medium,MSC-CM)治疗大鼠糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer,DFU)的疗效与机制。方法通过高脂饮食和腹腔注射STZ建立2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)SD大鼠模型,对大鼠后肢进行手术,制作DFU模型,大鼠分为正常对照(normal control,NC)组、糖尿病对照(diabetes mellitus control,DM-C)组、MSC-CM组和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)组共4组,每组各6只。MSC-CM组在溃疡周围注射大鼠骨髓MSC-CM,MSC组给予大鼠骨髓MSC注射治疗,其他两组给予PBS注射治疗。治疗后,对创面部位皮肤愈合、再上皮化(通过HE染色检测皮肤颗粒层的厚度)、细胞增殖(通过免疫组化法检测ki-67)、血管生成(通过免疫荧光法检测CD31)、自噬(通过免疫荧光法和Western blot法检测LC3B,电镜观察自嗜溶酶体)和细胞焦亡(通过Western blot法检测IL-1β、NLRP3、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N)进行评估。结果治疗后,MSC-CM组创面面积与IL-1β、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N均低于DM-C组;MSC-CM组皮肤颗粒层厚度、ki-67、CD31和LC3B均高于DM-C组。对DFUs大鼠注射MSC-CM能够加速创面愈合、促进细胞增殖和血管生成、增强细胞自噬和减少创面中的细胞焦亡。结论MSC-CM可用于治疗大鼠DFU,加速伤口愈合过程,有望成为一种新的无细胞治疗方法。

特定培养基条件下大鼠脂肪间充质干细胞体外定向软骨细胞的分化

目的:体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,并对分化细胞进行相应鉴定,观察脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2005-05/2006-05在湘雅医院中心实验室完成。①取大鼠腹股沟脂肪,消化分离脂肪间充质干细胞进行原代培养。②流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞表面CD29,CD34,CD44表达。③传3代细胞进行微团培养1d,换用含体积分数为0.01的新生牛血清、10μg/L的转化生长因子β1、6.25mg/L的胰岛素、6.25mg/L的转铁蛋白、1×10-7mol/L的地塞米松、50mg/L的维生素C的高糖DMEM诱导液,为特定培养条件。④在诱导后4,7,14d应用阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学评价软骨形成情况。⑤反转录-聚合酶链反应在诱导后0和14d检测脂肪间充质干细胞前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞的形态特征:原代脂肪间充质干细胞呈短梭形、梭形及多角形,3代后呈均一长梭形。②脂肪间充质干细胞的表面标志鉴定:脂肪间充质干细胞表达CD29,CD44,基本不表达CD34。③脂肪间充质干细胞诱导后的形态特征:脂肪间充质干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形,逐渐聚集成结节。④脂肪间充质干细胞诱导后的细胞化学染色结果:诱导后脂肪间充质干细胞胞外基质阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色、和Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性。⑤反转录-聚合酶链反应检测结果:反转录-聚合酶链反应检测未诱导脂肪间充质干细胞不表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因,而诱导后的脂肪间充质干细胞表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因。结论:脂肪间充质干细胞在由转化生长因子1、胰岛素、转铁蛋白等组成的特定培养基条件诱导下可以定向软骨细胞分化。

脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤

背景:有研究显示脂肪干细胞参与烫伤后皮肤组织的修复,但利用脂肪干细胞分泌物制备水凝胶,并治疗皮肤烫伤的研究尚未见报道。目的:分析人脂肪干细胞条件培养基水凝胶外用治疗小鼠皮肤烫伤模型的疗效。方法:采用酶解联合贴壁培养法,从脂肪组织培养获得脂肪干细胞并进行鉴定。取稳定增殖期细胞,收集其条件培养基,加入壳聚糖、甘露醇、β-甘油磷酸钠和透明质酸等制备温敏水凝胶,同时用新鲜脂肪干细胞完全培养基制备水凝胶。24只C57BL/6小鼠背部脱毛后用95℃铝块烫伤10 s快速建立3度皮肤烫伤模型,右侧以脂肪干细胞条件培养基水凝胶每天涂抹2次;左侧使用脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶每天涂抹2次,连续涂抹7 d,观察愈合时间与愈合进程,计算愈合率,在烫伤后第4,14,28天取材进行苏木精-伊红染色观察组织病理学变化。结果与结论:①人脂肪间充质干细胞为成纤维状,增殖旺盛,平均倍增时间为55 h,可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,高表达CD29、CD44、CD90和CD105,低表达CD31和CD34,证明其符合间充质干细胞的标准;②用人脂肪间充质干细胞条件培养基制备的温敏水凝胶在4-20℃呈现为清凉透明的黏稠液体,放入37℃15 min变为半固态凝胶;③95℃铝块烫伤小鼠表皮、真皮及皮下脂肪和肌肉组织的正常结构完全破坏,符合严重的3度烫伤标准,伤口面积均大致为3 cm^2;④在修复过程中发现,与新鲜培养基水凝胶对照组相比,脂肪干细胞条件培养基水凝胶组创口愈合时间短,伤口整洁,瘢痕增生少,创面组织结构恢复好;⑤脂肪干细胞条件培养基水凝胶组炎症浸润深度、炎症浸润细胞密度、肉芽组织厚度、成纤维细胞密度、新生血管密度和表皮厚度等指标显著好于新鲜培养基水凝胶组,差异有显著性意义(P<0.05);⑥以上结果表明,人脂肪间充质干细胞条件培养基水凝胶可有效促进烫伤皮肤伤口愈合,提高再生皮肤质量。

间充质干细胞条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附的影响

本研究探索间充质干细胞(MSC)条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附能力的影响及其可能的机制。采用经典全骨髓贴壁法培养MSC,用流式细胞术鉴定MSC表面标志特征。收集MSC条件培养液(MSC-CM),过表达基质细胞细胞衍生因子1(SDF-1)的MSC条件培养液(Ad-SDF-1-MSC-CM),以2%FBS-DMEM、15%FBS-DMEM培养液为对照,将MSC-CM、Ad-SDF-1-MSC-CM等条件培养液加入人脐静脉内皮细胞株(CRL1730)作用24 h后,用MTT法检测CRL1730细胞的增殖情况,利用划痕法和黏附模型评价MSC-CM对CRL1730细胞迁移能力和黏附能力的影响。结果表明,与MSC-CM相比,Ad-SDF-1-MSC-CM处理的CRL1730细胞表现出更强的增殖能力,加入阻断剂AMD3100后,MSC-CM所介导的促增殖效应明显降低。MSC-CM、Ad-SDF-1-MSC-CM促进CRL1730细胞的迁移,AMD3100明显抑制其所介导的CRL1730细胞迁移。与MSC-CM相比,Ad-SDF-1-MSC-CM处理的CRL1730细胞黏附能力明显增强,AMD3100能显著降低其增强CRL1730黏附能力的作用。结论:MSC-CM对CRL1730细胞的促增殖、迁移和黏附能力与其分泌的细胞因子SDF-1密切相关。

高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化

背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一。目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成。材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意。方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60min,过滤后离心,将位于最下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×109L-1接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养,待细胞接近80%～90%融合时消化传代。取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导。主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能。结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列。P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA-DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G0/G1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2d处于生长潜伏期,第3～6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次。成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性。结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞条件培养液对急性百草枯中毒肺损伤的影响

目的通过将骨髓间充质干细胞(BMSCs)条件培养液注入到急性百草枯中毒大鼠体内,观察其对急性百草枯中毒肺损伤的影响。方法选4周龄SPF级雄性SD大鼠,原代培养BMSCs,传至第3代的BMSCs无血清培养24 h,收集的培养基即为BMSCs条件培养液。将30只SPF级雄性大鼠随机分为3组:百草枯组、BMSCs条件培养液治疗组(治疗组)、正常对照组。将BMSCs条件培养液通过尾静脉注入各组大鼠体内,观察各组大鼠肺组织肺泡炎评分、肺组织α-SMA表达水平和各组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β的水平变化。结果与百草枯组相比,治疗组肺泡炎症反应较轻,肺组织α-SMA表达水平较低(P<0.05),血浆中TNF-α、IL-1β的含量较低(P<0.05)。结论 BMSCs条件培养液可减缓急性百草枯中毒引起的肺损伤。

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2组(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actinmRNA的表达。[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达。实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组。[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用。

磷酸鞘胺醇1协同条件培养液促进人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化(英文)

背景:研究显示磷酸鞘胺醇1(sphingosine-1-phosphate,S1P)可诱导脂肪干细胞分化成平滑肌细胞。S1P是否可替代5-氮杂胞苷作为间充质细胞分化为心肌细胞的诱导剂尚不清楚。目的:探讨S1P促进在不同培养液诱导下的人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的可能性。方法:收集培养人心肌细胞的条件培养基(cardiomyocytes condition medium,CMCM),分别用CMCM和(或)S1P培养人脐带间充质干细胞,在培养的第1,5,10天,观察人脐带间充质干细胞的形态学变化。培养10d后,应用免疫细胞化学和膜片钳鉴定细胞表型及细胞功能。结果与结论:随着培养时间的延长,CMCM组和CMCM+S1P组的一些细胞逐渐增大,拉长,与邻近细胞连接并形成肌管样结构,其中一些细胞聚集成簇。在CMCM+S1P组中,细胞出现特殊的垂直对齐梯田状,类闰盘样排列。同时,免疫细胞化学染色结果显示,CMCM组和CMCM+S1P组中一些细胞强烈表达心肌特异性抗体(心肌肌球蛋白重链和横纹肌辅肌动蛋白α),说明人脐带间充质干细胞在CMCM诱导下可分化为心肌样细胞。膜片钳仅在CMCM+S1P组的部分细胞记录到一个快速上行,但无平台期的动作电位,以及一个电压依赖性内向电流和一个电压依赖性外向电流。说明S1P在促进人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化和功能整合中发挥关键作用。