鲤脂蛋白脂肪酶基因特性、表达分布、重组蛋白获得及酶活性比较

为研究鲤脂蛋白脂肪酶(CcLPLs)的基因特征、时空表达分布及酶活性,实验利用基因组同源搜索获取鲤CcLPLs同源基因并分析其序列特征;通过荧光定量PCR(qPCR)方法对CcLPLs在不同组织的表达进行分析;采用原核表达系统获取CcLPLs重组蛋白,并使用对硝基苯酚法测定各重组蛋白的酶活性。结果显示,鲤基因组中挖掘到5个CcLPLs基因(CcLPLA1a、CcLPLA1b、CcLPLA2a、CcLPLA2b*和CcLPLBa),经验证,CcLPLA2b*是假基因,共线性分析显示,鱼类特有基因组加倍过程中出现基因丢失的现象,而鲤特有的基因组加倍致使鲤存在5个CcLPLs。CcLPLA1a和CcLPLA1b核苷酸序列和氨基酸序列相同,同源性分析显示,CcLPLBa与CcLPLA1s的同源性为64%,与CcLPLA2a同源性为50.8%。qPCR结果显示,CcLPLs的表达量在肝脏、心脏、脂肪、肌肉、脑、肠道和脾脏中依次降低,在各个组织中,各基因表达量从高到底依次为CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa。鲤正常投喂、饥饿及再投喂状态下CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏、肌肉和脂肪组织中的表达结果显示,饥饿状态下,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中的表达量高于正常投喂组,而在肌肉和脂肪中低于正常投喂组;再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中表达水平降至正常投喂组,而在肌肉和脂肪中表现为先升高后降低的趋势。通过构建具有促溶效果的原核表达载体,分别获得了原核表达重组蛋白Skp-CcLPLs和SlyDCcLPLs,酶活性测定结果显示,重组蛋白其脂蛋白脂肪酶活性从高到低依次为CcLPLA1a、CcLPLBa和CcLPLA2a,最适pH均为8.0,发挥最大活性的NaCl浓度为0.6 mol/L。本研究探讨了鲤CcLPLs同源基因在进化中的表现,对CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa的时空表达进行了分析,测定了投喂和饥饿对CcLPLA1s、CcLPLA2a表达的影响,揭示鲤饥饿胁迫下脂质代谢及响应对策,为控制鲤脂肪含量提供靶点,成功进行重组蛋白的原核表达并测定了其酶活性,为鱼类脂蛋白脂肪酶研究提供参考。