幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20重组抗原的可溶性表达及其免疫学性质分析

[目的]利用原核表达系统表达幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20(rLpp20),分离纯化获得重组融合蛋白rLpp20,利用其制备抗rLpp20多克隆抗体,并分析其抗体的特异性。[方法]利用生物信息学软件分析rLpp20的抗原结构;通过拼接引物PCR法,获得幽门螺旋杆菌Lpp20基因序列,将其插入到质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rLpp20,转入大肠杆菌Arctic Express中;经IPTG诱导表达rLpp20后,超声波裂菌,用Ni-IDA柱亲和纯化获得目的蛋白rLpp20。然后,利用Western Blot鉴定rLpp20与anti-H.pylori和anti-His tag的免疫反应性;最后,脂蛋白重组抗原rLpp20与弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,制备anti-Lpp20多克隆抗血清,利用ELISA鉴定anti-Lpp20的抗体特异性。[结果]利用生物信息学软件证实rLpp20具有较好的抗原性;重组质粒pCZN1-rLpp20经双酶切和基因测序鉴定,证实rLpp20序列与理论值一致;基因工程菌株pCzn1-rLpp20/Arctic Express可以以可溶形式表达rLpp20,经Ni-IDA亲和层析柱纯化,纯度约达98.2%。Western Blot结果证实:重组抗原rLpp20可特异性与anti-H.pylori和anti-His tag结合。ELISA结果证实:所制备的anti-Lpp20抗血清具有良好的抗体特异性,可特异性识别rLpp20和H.pylori裂解物。[结论]利用E.coli Arctic Express实现了脂蛋白重组抗原rLpp20的可溶性表达,经Ni-IDA柱亲和纯化获得了高纯度rLpp20;脂蛋白重组抗原rLpp20具有良好的免疫反应性和特异性,为进一步研制幽门螺旋杆菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了良好的实验基础。

幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性

【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的基因,分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础。方法根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测。结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体。