脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

脂质体介导bcl-x_L反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞株凋亡的影响

背景与目的:实验证明bcl-xL在鼻咽癌CNE-2Z细胞中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要的作用。本研究以脂质体(lipofectin)为载体,将人工合成的bcl-xL反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)片段导入CNE-2Z细胞,拟探讨ASODN对CNE-2Z细胞的影响。方法:以bcl-xL的编码区为靶点,人工合成20个碱基全硫代修饰的反义寡核苷酸,脂质体转染反义寡核苷酸进入CNE-2Z细胞后,用MTT法检测细胞成活率;用琼脂糖凝胶电泳、荧光染色、流式细胞术等方法检测细胞凋亡。结果:MTT结果发现,ASODN在Lip介导下即可显著抑制CNE-2Z细胞株细胞增殖(P<0.01),ASODN对细胞增殖的抑制作用随其浓度增加而增强;ASODN作用细胞36h后,经Hoechst33258/PI双染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩、核断裂;流式细胞仪分析发现在G1峰前出现一个亚二倍体峰即凋亡峰;琼脂糖凝胶电泳分析可见ASODN/Lip处理组出现明显的“梯状”外观等凋亡特征性改变。结论:ASODN脂质体转染CNE-2Z细胞后可促进CNE-2Z的细胞凋亡;在肿瘤研究中,bcl-xL可作为一个有用的靶基因,为开发鼻咽癌基因治疗药物提供实验依据。

脂质体介导的融合基因pCEAcd/tk转染肺癌细胞株效率的差异性

对脂质体介导的体外肺癌细胞DAN转效率的差异性进行研究。方法 :提取质粒 pCEAcd/tk ,脂质体包裹后转染 6种肺癌细胞株 ,G418筛选 ,计数细胞阳性克隆数。结果 :6种肺癌细胞株中 ,导入了pCEAcdt/tk并获得稳定表达的细胞阳性克隆数差异较大 ;脂质体ESCORT -DNA混合物与细胞孵育时间不同对转染效率也有一定的影响。结论

脂质体介导姜黄素抑制Bel-7402细胞增殖和诱导其凋亡的作用

目的:研究提高姜黄素治疗肝癌生物学效应的新技术和新方法。方法:对比观察脂质体姜黄素水溶制剂对人肝癌细胞(Bel7402)凋亡及凋亡相关调控基因Bax、Bcl2的影响。MTT(四甲基偶氮唑蓝)法观察脂质体姜黄素对Bel7402细胞增殖的抑制作用。原位末端标记法(TUNEL技术)观察脂质体姜黄素诱导Bel7402细胞凋亡的作用。免疫组织化学染色(SABC)法检测脂质体姜黄素对Bax和Bcl2基因表达的影响。结果:10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml脂质体姜黄素对Bel7402细胞增殖有显著抑制作用,P<0.01,其抑制率分别为38.67%、26.67%和17.33%,与同浓度的姜黄素的抑制率(29.33%、20.00%、5.33%)比较,差异有显著性意义(P<0.05);增殖抑制作用随药物浓度增高而有加强趋势,3个有效浓度组间差异均有显著性意义(P<0.05)。10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml脂质体姜黄素处理组Bel7402细胞凋亡率分别为68.9%、43.4%、26.9%,与同浓度姜黄素组的Bel7402细胞凋亡率(53.3%、30.2%、14.9%)比较,差异有显著性意义(P<0.05)。脂质体姜黄素对细胞凋亡相关基因Bax、Bcl2表达的影响,与对照组比较差异无显著性意义。结论:脂质体能显著提高姜黄素对Bel7402细胞增殖的抑制和诱导其凋亡的作用。脂质体姜黄素对Bax、Bcl2的表达无显著影响。

脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件

目的 探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法 细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果 最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论 通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 .

脂质体介导的体内外细胞因子基因转移效果的初步研究

本研究用反相蒸发技术制备出包裹IL-2 DNA或IL-6 DNA的脂质体,将其与体外培养的靶细胞共育,或将其直接注射至小鼠腹腔内及荷瘤小鼠的瘤体内,研究其介导体内外基因转移的效果,结果表明我们研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中,并可通过腹腔内注射及瘤体内注射后,在腹腔内及肿瘤原位直接将IL-2和IL-6基因转移至腹腔细胞及肿瘤细胞中,稳定表达IL-2和IL-6。

脂质体介导ANG反义核酸对A549细胞作用的研究

目的 研究脂质体介导ANG反义核酸转染A5 49细胞后 ,对其中ANG蛋白表达的影响 ,探讨其作为抗血管生成与抗肿瘤药物的可行性。方法 用人工合成的人ANG反义寡聚核苷酸 ,以脂质体为载体转染人肺癌A5 49细胞 ,研究A5 49细胞在基因转染后 ,其ANG蛋白表达的变化。结果 脂质体转染程序优化后 ,得到最佳转染效率 ;免疫组化显示细胞内ANG蛋白表达明显减少 ;培养基ELISA检测显示每细胞分泌的ANG蛋白量与对照组相比有显著差异。结论 ANG反义寡聚核苷酸抑制A5 49细胞中ANG的表达 。

脂质体介导的鲫CAB细胞转化及转化细胞的核移植

采用脂质体法成功地使ｇｆｐ基因转入鲫囊胚细胞株ＣＡＢ细胞基因组，获得了具有Ｇ４１８抗性的细胞。以转化细胞为供体，银鲫卵为受体，核移植得到了转基因的囊胚和原肠胚；并发现４℃处理细胞２４ｈ能显著改善核移植胚胎的发育。

脂质体介导的IGF-1R反义寡核苷酸抗胰腺癌的实验研究

目的研究辐射促进脂质体(lipofectin)介导的胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)反义寡核苷酸(ASON)抑制人胰腺癌细胞系PC-3的生长及接种裸鼠后的成瘤性。方法PC-3细胞经不同剂量60Co照射后,绘制剂量存活曲线,选择照射剂量。用噻唑蓝(MTT)比色法比较脂质体介导的ASON(lipo-ASON)直接转染与联合照射转染对PC-3细胞的抑制效果,用流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测两种转染方法对PC-3细胞凋亡率及IGF-1RmRNA表达的影响。裸鼠种植PC-3细胞,肿瘤直径为5mm时,比较不同条件下(肿瘤局部照射与不照射)瘤内注射IGF-1Rlipo-ASON对肿瘤的抑制情况。结果Lipo-ASON联合照射对胰腺癌细胞的抑制率(86.3%)、凋亡率(53.06%)及IGF-1RmRNA水平降低程度(降低79.2%)均明显高于未照射组(51.1%、20.23%和45.6%),差异有显著性。照射后瘤内注射lipo-ASON组的肿瘤体积明显小于其他各组,空白对照组与联合照射的lipo-ASON组、Lipo-ASON组肿瘤体积差异有显著性(P<0.01)。结论针对IGF-

阳离子脂质体介导HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响

目的 探讨HSV TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法 用阳离子脂质体Lipofectamine将 pCR3 Uni及含HSV TK基因的真核表达载体 pCR3 TK转染至人脑胶质瘤细胞株TJ90 5中 ,筛选出阳性克隆 ,阳性细胞克隆给予ACV(5 0mg/ml) ,72小时后 ,收集玻片 ,进行AgNOR染色。 结果 转染HSV TK基因的细胞 ,在给予ACV后 ,细胞增殖活性明显降低 ,转染 pCR3 Uni和 pCR3 \|TK细胞克隆的AgNOR颗粒数分别为 1 4.3 3和 6.67(P <0 .0 1 )。结论 AgNOR计数是一种操作简便、检测细胞增殖活性的方法 ,为研究HSV

阳离子脂质体介导的角膜内皮细胞基因转染研究

目前治疗角膜病致盲的惟一方法是角膜移植,但因供体有限且50%以上因内皮细胞密度太低而不能用.应用基因转染技术,增加活体或供体角膜内皮细胞密度有望解决这一临床难题.

脂质体介导法转染体细胞效率的优化

为建立脂质体介导的高效体细胞转染体系,采用脂质体TransfastTM包裹编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pCMV-EGFP质粒,转染5～13代山羊胎儿成纤维细胞,并用流式细胞仪检测不同DNA剂量、细胞汇合度、血清、转染时间及脂质体与DNA比例等参数对转染效率的影响。实验发现0.75μgDNA按1∶1的脂质体与DNA比例,在无血清条件下转染汇合50%细胞3h,转染效率最高可达40.7%±5%。4h转染时间、细胞汇合80%及转染体系中有血清会降低转染效率。随着DNA剂量的增加,转染效率呈剂量依赖性增高,但山羊成纤维细胞的活细胞数显著下降。实验表明TransfastTM能高效安全地介导外源基因转染山羊成纤维细胞。

瘤体内脂质体介导的IL-2基因治疗后肿瘤和肿瘤浸润性淋巴细胞的功能变化

自Rosenberg等1986年发现IL-2激活的TIL具有极强的体内外杀伤肿瘤细胞的作用后，人们相继对TIL的表型、体内分布、TIL在肿瘤部位的存活时间以及TIL配合IL-2的治疗效果等进行了大量的研究，TIL作为分布于肿瘤局部与肿瘤直接接触的免疫细胞．其功能和数量的变化既是荷瘤机体疾病的程度和预后的直接反应，

脂质体介导的人α-干扰素基因转移的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察

肿瘤的基因疗法近年来有了飞速的发展，其中被认为很有希望在肿瘤基因治疗领域有所突破的途径之一就是肿瘤细胞靶向的细胞因子基因疗法。(Tumor cells-targeted cytokine gene thempy)α-干扰素(IFN-α)是一种经大量临床应用证实了的具有显著免疫调节作用和抗肿瘤、抗病毒作用的细胞因子：因此，

脂质体介导的^(99m)Tc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的 探讨脂质体介导的 99m Tc标记癌基因 c- m yc m RNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达。方法 合成 15 bp的癌基因 c- m yc m RNA的反义、正义及无义寡核苷酸 ,用 99m Tc标记后 (简称 99m Tc- DNA) ,一部分用脂质体包裹 ,以不同放射性强度的 99m Tc- DNA及脂质体包裹的 99m Tc- DNA转染细胞 ,于转染后不同时间测定细胞摄取率 ,在转染后 18h测定细胞返流比率 ,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况 ,用流式细胞术测定癌蛋白的表达。结果 在 1～ 5 h内 ,细胞的摄取率随时间的延长而增加 ,脂质体包裹的 99m Tc- DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的 99m Tc- DNA。四唑盐比色实验 ,随着脂质体介导的 99m Tc-反义 DNA剂量的增加 ,细胞数量逐渐减少 ,而正义、无义寡聚核苷酸组 ,细胞数量则没有减少的趋势。细胞的返流比率 ,反义、正义、无义寡核苷酸分别为 3 9.5 1%、44 .12 %、63 .92 %。测定癌蛋白的荧光强度 ,反义寡核苷酸组 2 .9860± 0 .3 73 3、正义寡核苷酸组 4.2 60 0± 0 .2 2 18、无义寡核苷酸组 5 .2 62 0± 0 .85 62 ,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组。结论 脂质体介导的99m Tc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表?

脂质体介导外源性基因在骨髓基质细胞表达

目的:用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞,并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法:构建的重组载体鉴定后,以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率;转染后48h进行细胞免疫组化染色检测目的基因的表达情况。结果:限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX 1基因;克隆的目的片断经序列测定与GenBank公布的序列一致;质粒∶脂质体为1∶1或1∶2的转染效率最佳;细胞免疫化学染色检测证实转染后骨髓基质细胞有PDX 1基因表达。结论:成功构建了含有PDX 1基因的真核表达载体;通过优化转染条件提高了pEGFP PDX 1转染大鼠骨髓基质细胞的效率,为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。

缺血性脑损伤后大鼠脑中脂质体介导外源基因的表达

目的 探讨在短暂、局灶性脑缺血后 ,脂质体介导的外源基因能否在大鼠脑组织中有效的表达。方法 将大鼠一侧大脑中动脉栓塞 1h以制作短暂、局灶性脑缺血模型。根据行为实验来判定模型制作是否成功。将含报告基因LacZ的质粒和脂质体的复合体注入实验组大鼠的脑脊液中 ,对照组只注射脂质体。 7d后取动物脑组织 ,通过组织化学和逆转录酶 多聚酶链反应 (RT PCR)等方法来鉴定外源基因是否表达。结果 转染LacZ基因的缺血性脑损伤大鼠脑组织中 ,其表达产物 β 半乳糖苷酶在皮质、皮质下区域的细胞及脉络丛中均呈阳性表达 ;在缺血中心区域 ,表达 β 半乳糖苷酶的细胞数很少 ;在缺血周边区域 ,表达β 半乳糖苷酶的细胞数较多 ;而非缺血区域表达 β 半乳糖苷酶的细胞明显较缺血中心区域为多 ;其脑组织中LacZmRNA在RT PCR实验中亦呈阳性。只注射脂质体的缺血大鼠脑组织中 ,β 半乳糖苷酶和LacZmRNA的检测均为阴性。 结论 缺血性脑损伤发生后 ,脂质体介导的外源基因可在脑组织中有效表达。脂质体介导的基因转染可能是治疗缺血性脑损伤的一种有效方法。

大鼠肝移植中脂质体介导IL-10基因转染供肝的实验研究

目的 观察供肝转染 IL- 10后基因表达情况。方法 应用改良“二袖套法”行 Lewis到 BN大鼠肝移植11例,然后分为对照组3例; 空载体转染组4例,术中供肝冷保存期门静脉注射 Lipofectamine 2000 pCR3.1 空载体质粒复合物,保存45 min后行肝移植; 重组 IL- 10(rIL- 10)转染组 4 例,术中供肝冷保存期门静脉注射 Lipo fectamine 2000 pCR3.1 rIL- 10复合物,保存45 min后行肝移植。术后第 6 天处死全部大鼠,取血清检测 IL-- 10 水平,另取肝组织行免疫组化染色和RT PCR检测肝细胞 IL -10 表达水平。结果 rIL- 10 转染组血清 IL -10 水平明显升高,肝上下腔静脉 IL 10 水平可达( 639. 27±67. 11 ) pg/ml,是肝下下腔静脉 IL 10 水平的近 1. 4 倍(P=0.024); 免疫组化染色结果示肝细胞胞桨呈棕黄色或深棕色,而其他两组肝细胞着色轻微或不明显。肝组织RT -PCR显示,IL- 10 mRNA的表达在 rIL -10转染组明显处于高水平(P=0.000)。结论 脂质体介导,体外冷保存期经门静脉途径进行供肝转染 IL- 10,可以使 IL -10在肝脏获得较高水平的表达。