人用狂犬病毒脂质体疫苗的制备及性质

目的制备人用狂犬病毒脂质体疫苗,并考察其制剂学及毒理学性质。方法以氢化大豆磷脂、胆固醇、十八胺为原料,采用反相蒸发法(REV)制备脂质体,加入纯化狂犬病毒抗原,以冻干重建法(DRV)制备狂犬病毒脂质体疫苗。在电镜下观察其形态,测定其包封率和体外释放率,用激光衍射粒度分析仪测定其粒径分布及平均粒径,并进行局部刺激性、过敏反应及异常毒性试验。结果所制备的狂犬病毒脂质体疫苗形态呈圆形或椭圆形,粒径分布均匀,平均粒径为12.25μm左右,包封率在60%以上。无刺激性,无异常毒性,过敏反应检测合格。结论所制备的狂犬病毒脂质体疫苗性质稳定,可作进一步研究。

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 。

斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗研究

采用反相蒸发法制备嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗,通过灌胃分别给予各组斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)脂质体疫苗(Ⅰ-Ⅲ组)、嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗(Ⅳ组)和生理盐水(Ⅴ组),每2周给药1次,共3次。于接种疫苗后第1天、14天、28天和第49天采集静脉血,测定白细胞的杀菌活性和血清抗体IgM含量的变化,并用细菌攻毒实验检测免疫保护效应。结果显示,本实验制备的脂质体疫苗粒径约为(0.9±0.3)μm,包封率为53.23%,与嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗相比能显著增强斑点叉尾鮰吞噬细胞的杀菌活性和血清抗体IgM水平。腹腔注射活菌攻毒后,脂质体疫苗免疫的Ⅰ-Ⅲ组的相对免疫保护率分别为34.8%、48.2%和55.4%;而嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗免疫的Ⅳ组的相对免疫保护率仅有6.7%,生理盐水对照Ⅴ组保护率则为零。研究表明,口服脂质体疫苗对斑点叉尾鮰具有显著的免疫保护效应,可作为预防嗜麦芽寡养单胞菌感染的疫苗。

新城疫病毒外膜蛋白脂质体疫苗的实验研究

本研究以冷冻干燥法制得新城疫病毒 ( NDV)外膜蛋白脂质体疫苗。两次免疫后 SPF鸡的血清 HI抗体效价结果显示 :NDV外膜蛋白脂质体疫苗免疫组的算术平均滴度要高于仅以 NDV外膜蛋白免疫组 ,二者间具有显著性差异 ( P<0 .0 5) ,且前者以 NDV强毒株攻击后的保护率达1 0 0 %,也优于单纯以

HPLC-ELSD法测定BLP25脂质体疫苗中MPL的含量

目的建立测定BLP25脂质体疫苗中免疫佐剂MPL含量的方法。方法采用HPLC-蒸发光散射检测器(ELSD)法。色谱柱为孔径300A的WP Octadecyl C18柱;采用三元梯度洗脱;Alltech 2000型ELSD检测器的漂移管温度为80℃,载气流速为2.6L.min-1。结果所建方法能将MPL与脂质体中的其他成分完全分离;在48.6～486μg.mL-1浓度范围内,MPL校正曲线(lgA～lgC)的线性相关系数(r)为0.9998;平均加样回收率为100.0%(n=3×3);连续进样、平行配制溶液、不同操作人员、不同实验室测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为0.8%(n=6)、1.3%(n=3)、1.7%(n=2)和2.8%(n=3)。结论该HPLC-ELSD方法的专属性、线性、准确度、精密度和重现性均符合方法学要求,适宜于BLP25脂质体疫苗中MPL的含量测定。

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗的研制

目的探索用脂质体包裹空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,CJ)28-31KD(即PEB1、PEB2、PEB3、PEB4)外膜蛋白制备安全、稳定、有效的CJ亚单位脂质体佐剂疫苗。方法采用薄膜-超声-冻融法制备阴离子脂质体(AL)、阳离子脂质体(CL)CJ28-31KD外膜蛋白亚单位佐剂疫苗,通过电子显微镜观察脂质体疫苗微粒的形态、测其粒径及分布,进行稳定性检测、无菌试验、热原质试验、疫苗的不良反应观察及包裹率检测等疫苗质量鉴定。结果1疫苗都为均匀乳白色混悬液,无分层和沉淀现象,阴离子脂质体疫苗颗粒形态呈球形,平均直径250nm,分布均匀,阳离子脂质体疫苗颗粒大,不规则;2两种疫苗的无菌试验及热原质试验均合格,不良反应观察结果均无明显不良反应;3阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32.1%、22.5%,冻融后分别是38.3%、28.4%。结论采用薄膜-超声-冻融法制备CJ亚单位佐剂疫苗是可行的;制备的疫苗是安全、稳定的;冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率。

脂质体作为疫苗佐剂的研究进展

总结近年来的有关文献,对疫苗免疫佐剂的研究现状及主要的免疫佐剂脂质体的理化性质与免疫原性、脂质体疫苗的特点进行了归纳、分析和综述,对脂质体作为疫苗免疫佐剂存在问题及研究方向提出建议。

单价流感疫苗脂质体干粉细胞免疫研究

从细胞免疫水平考察流感疫苗脂质体干粉肺部免疫的免疫原性,以验证在稳定性提高的同时,流感疫苗脂质体干粉肺部免疫原性不低于现行应用的流感疫苗原液腹腔注射免疫。将实验小鼠分为2个大组,每组分为阴性对照组、疫苗脂质体冻干粉组、非脂质体流感疫苗原液组和阳性对照组(n=5)。非脂质体流感疫苗原液组和疫苗脂质体冻干粉组分别以每只6μg血凝素(以H1N1计)肺部灌注免疫,同时以每只6μg非脂质体流感疫苗原液组腹腔免疫作为阳性对照。分别免疫14 d和28 d后,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况,以考察其细胞免疫原性。脂质体肺部免疫可以诱导细胞免疫,且其免疫原性明显高于流感疫苗原液传统腹腔注射免疫组。与流感疫苗原液腹腔注射免疫相比,流感疫苗脂质体干粉通过肺部免疫,细胞免疫效果明显提高。

流感疫苗脂质体冻干粉的制备及其免疫原性

目的:制备流感疫苗脂质体冻干粉,并考察其粒径分布、包封率及免疫原性。方法:以大豆卵磷脂、胆固醇为原料,采用薄膜蒸发法,加入纯化流感病毒裂解疫苗制备脂质体,加入冻干保护剂冻干。在光学显微镜下观察其形态,并在透射电镜下测定其平均粒径和粒径分布,以Lowry法测定其包封率。小鼠肺部给药后血凝抑制法测定抗体滴度以考察其免疫原性。结果:所制备的流感疫苗脂质体冻干粉复溶后呈圆形和椭圆形,粒度分布均匀,平均粒径约为2.14μm,包封率大于80%。肺部免疫后抗体滴度较腹腔免疫高。结论:所制备的流感疫苗脂质体包封率高,粒度分布均匀,小鼠肺部免疫效果好。流感疫苗脂质体肺部免疫是一种很有潜力的免疫途径,有待进一步研究。

流感疫苗脂质体干粉的稳定性

考察制备的流感疫苗脂质体干粉的物理稳定性,确定加入的抗氧化剂维生素E(VitE)用量以及在该用量下产品的生物学稳定性。将样品分别储存于(37±2)℃,(25±2)℃,4℃下,于规定时间取样测定包封率,以此考察其物理稳定性,发现(37±2)℃下储存14d内稳定;(25±2)℃下90d内稳定;4℃下180d内稳定。脂质体中加入不同量VitE,储存于(37±2)℃下,于不同时段取样测定包封率和氧化指数,筛选最佳VitE用量为5%,将含5%VitE的流感疫苗脂质体干粉于(37±2)℃储存,于1,14,21d取样,以含6μg血凝素的流感疫苗脂质体对小鼠肺部灌注免疫后用红细胞凝集抑制法测定抗体滴度,以考察其生物学稳定性,发现该干粉储存21d后免疫后与免疫前抗体滴度比达19.1,表明流感疫苗脂质体干粉(37±2)℃储存21d的生物学稳定性良好。

冻融-冻干法制备的流感疫苗脂质体的细胞免疫研究

分别用冻融-冻干法、薄膜分散-冻干法制备流感疫苗脂质体干粉,通过小鼠肺部免疫后,从细胞免疫水平考察两种方法制备脂质体的免疫原性。将小鼠分为非脂质体疫苗原液组(non-liposome)、薄膜分散-冻干法制备流感脂质体疫苗组、冻融-冻干法制备流感疫苗脂质体组、阳性对照和阴性对照组(n=5)。脂质体疫苗冻干粉组以每只血凝素含量(以H1N1计)6μg肺部免疫,以非脂质体疫苗原液每只血凝素含量6μg腹腔给药作为阳性对照,以未免疫小鼠(PBS给药)为阴性对照。免疫28d,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,流式细胞术检测CD4^+与CD8^+细胞。结果显示:两种方法制备的流感疫苗脂质体冻干粉均可诱导细胞免疫,且免疫效果相当,说明冻融-冻干法有望进一步应用于减毒活疫苗制备。

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫原性研究

目的探索用脂质体包裹空肠弯曲菌（Camffylobaeter jejuni，CJ）Mr28000～31000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的cJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径。方法采用薄膜一超声一冻融法制备阴离子脂质体（AL）、阳离子脂质体（CL）GJ疫苗后对其进行质量鉴定；用ELISA（间接法）检测经GJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体水平。结果①疫苗无菌试验及热原质试验均合格，均无明显不良反应；②阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32．1％、22．5％，冻融后分别是38．3％、28．4％；③CJ阴离子组比GJ阳离子组血清IgG的OD值显著增高（P〈0.01），与GJ弗氏组无统计学差别（P〉0.1）；CJ阴、阳离子组0．50mg／kg的免疫剂量血清IgG的0D值最大；CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgG的0D值无统计学差别（P〉0．1）；特异性IgG抗体经6个月动态观察，5个月后抗体效价下降。结论①采用薄膜-超声-冻融法制备GJ亚单位佐剂疫苗安全、稳定，冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率；②同一剂量的阴离子脂质体疫苗血清抗体水平明显高于阳离子脂质体疫苗；③脂质体疫苗最佳接种剂量为0．50mg／kg，肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异；④较高水平的特异性抗体维持5个月，6个月后应加强免疫。

一种流感疫苗脂质体的制备工艺开发

探讨一种制备流感疫苗脂质体的方法及其最佳处方并对其免疫原性及稳定性进行初步考查。以大豆卵磷脂、胆固醇为原料,采用薄膜分散法制备流感疫苗脂质体,用均匀设计法筛选流感疫苗脂质体的最佳处方。以包封率为指标,考查各因数对制备工艺的影响。结果表明最佳制备工艺为:PBS pH∶7.0,卵磷脂与胆固醇用量比:300∶100,流感疫苗用量:11 ml,PBS用量:20 ml。根据优化处方制得的流感疫苗脂质体包封率可达84.78%,呈圆形和椭圆形,粒度分布均匀,平均粒径为2.5μm左右,低温保存稳定,免疫原性好。