体外化学合成bcl-2 siRNA及脂质siPORT脂质体转染siRNA至细胞HL-60的鉴定

目的 为将RNA干扰技术深入应用到血液肿瘤做铺垫 ,体外化学合成bcl 2小干扰RNA(small interferenceRNA ,siRNA)及si PORT脂质体转染siRNA至细胞HL 6 0的鉴定。方法 通过互联网从GenBank获得人bcl 2mRNA全序列 ,经扫描bcl 2mRNA的全序列记录AA及下游 19个核苷酸肽并与基因组数据库比较去除与其它基因有高度同源性的序列 ,选取距离AUG启动子约 30个核苷酸以后的靶序列作siRNA模板的设计 ,且GC含量控制在 30 %～ 6 5 %之间。选择了三条序列作为我们实验设计的靶序列并由靶序列设计合成出它们的正、反义寡核苷酸肽模板。由化学合成试剂盒体外合成双链bcl 2siRNA ,纯化并定量后用Cy3红色荧光标记 ,利用脂质siPORT转染试剂将bcl 2siRNA转染入HL 6 0细胞 ,转染 4 8h后收集并固定细胞 ,荧光显微镜下观察转染结果。结果 纯化的siRNA经 2 %琼脂糖凝胶电泳证实其长度为 2 1bp ,说明bcl 2siRNA被成功合成。转染Cy3标记的siRNA 4 8h后的细胞荧光显微镜下经绿色光激发可见较亮的深红色荧光 ,而未转染bcl 2siRNA的细胞仅有微弱的红色自发荧光。结论 体外成功化学合成bcl 2siRNA ,LipidsiPORT转染试剂能将bcl 2siRNA成功转染入白血病细胞HL 6 0中。

基因递送中阳离子脂质体结构对转染效率及细胞毒性的影响研究进展

阳离子脂质体在基因治疗和基因沉默领域被广泛应用,其数量繁多,结构多样,有优化和改善基因递送行为的功能,随着基因治疗研究的逐渐深入,新型阳离子脂质体也被不断开发。阳离子脂质体主要有4个组成部分,即亲水的阳离子头部、疏水的脂质尾部、连接键以及辅助脂质,每个部分的结构对基因递送中阳离子脂质的转染效率和细胞毒性具有重要影响。可电离阳离子脂质细胞毒性较低,已有产品上市。本综述可为阳离子脂质体的设计提供一个概念框架,为阳离子脂质体的选择提供一定理论支持。

阳离子脂质体转染条件对转染效率的影响

分析不同浓度的四环素、阿奇霉素、氯霉素和庆大霉素和不同PH值、细胞状态对脂质体Lipo2000转染效率产生影响。方法 1.HeLa细胞转染前24小时在MEM培养基中分别加入不同种类不同浓度的抗生素,48小时后根据GFP阳性细胞数量分析抗生素对转染的影响。2.HeLa细胞转染前24小时放置在不同PH值的MEM培养基中,根据GFP阳性细胞数量分析不同PH值对转染的影响。3.观察 对在室温放置不同天数的HeLa细胞转染率,分析不同细胞状态对转染效率的影响。结果 1.不同种类抗生素以及同种抗生素不同浓度均对脂质体转染效率的敏感性不同,用庆大霉素作为抗生素转染效率最佳,四环素转染效率最差。2.不同转染细胞浓度条件下在PH=8.0碱性培养基中转染效率最佳。3.室温放置的细胞脂质体LipofectamineTM2000的转染效率显著降低。结论 使用庆大霉素抗生素以及在PH值8.0、细胞状态最佳条件下转染效率敏感性最高。

脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞:筛选理想浓度

背景:siRNA转染是完成RNA干扰的关键一步。目前用于心肌细胞的RNA干扰技术多以质粒为载体转染长链shRNA,其步骤复杂。脂质体转染化学合成短链siRNA是一种操作简便,低毒高效的转染方法,将其应用于心肌细胞转染,有利于RNA干扰技术的推广应用。目的:筛选脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的最佳浓度,以及简单高效的RNA干扰操作方法。方法:应用脂质体siPORTTMNeoFXTM转染试剂介导5,10,20,30nmol/L的CY3-NegativesiRNA转染心肌细胞,同时设立空白对照组,转染24h后分别应用荧光显微镜,流式细胞仪检测转染效率和细胞凋亡率,筛选最优浓度。根据优化浓度转染PHBsiRNA,48h后检测蛋白表达验证转染效果。结果与结论:随CY3-NegativesiRNA浓度的增加,在荧光显微镜下观察到激发出红色荧光的细胞比例随之增加,流式细胞仪检测出各组平均转染效率也依次增高(P<0.05),其中30nmol/L组转染效率最高(P<0.05),而各实验组与空白对照组之间的细胞凋亡率差异无显著性意义(P>0.05)。将心肌细胞转染30nmol/L的PHBsiRNA,48h后PHB蛋白表达平均下降74.11%(P<0.05)。实验结果表明,脂质体转染试剂siPORTTMNeoFXTM介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的理想浓度是30nmol/L。

siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。

磁性纳米颗粒与脂质体介导REST-siRNA转染hADSCs的比较

目的对聚乙烯亚胺包被的磁纳米颗粒(PEI-SPIO)与脂质体(lipofectamineTM2000)作为基因载体转染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的可行性及转染后细胞的增殖、转染效率及基因瞬时干扰效率进行比较分析。方法分别将PEI-SPIO和lipofectamineTM2000作为基因载体连接REST-siRNA体外转染hADSCs,用MTT法检测hADSCs增殖和功能;用荧光显微镜观察转染效率;分别用Real-time PCR和Western blot检测REST的表达。结果用磁性纳米颗粒和脂质体作为基因载体转染细胞后,细胞成活率分别为99%和79%(P<0.05);磁纳米颗粒和脂质体的转染效率无差异,分别为75%和71%;磁纳米颗粒和脂质体作为基因载体时RNA表达量分别为(0.46±0.04)和(0.53±0.05),蛋白水平表达量分别为(0.501±0.006)和(0.523±0.004)。结论磁性纳米颗粒因其具有低细胞毒性可代替脂质体作为转染干细胞的基因载体。

脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默星形胶质细胞AQP4基因

目的明确脂质体RNAiMAX(lipofectamine RNAiMAX)是否可以介导小干扰RNA(siRNA)转染入原代培养星形胶质细胞并实现水通道蛋白4(AQP4)基因沉默。方法利用原代培养的Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞,通过倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪,观察lipofectamine RNAiMAX是否能介导Cy3标记的siRNA转染入细胞内,以及RNAiMAX浓度和siRNA浓度对转染效率的影响;利用Real-time PCR方法检测AQP4 siRNA转染的基因沉默效果。结果倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪检测发现,随着siRNA和RNAiMAX浓度的增加,转染细胞荧光强度随之增加(n=6);Real-time PCR检测结果显示,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA以及6ml/L RNAiMAX和60nmol/L AQP4 siRNA转染星形胶质细胞24h、48h、72h时,AQP4 mRNA水平均降低80%以上(n=6)。结论 Lipofectamine RNAiMAX可以介导siRNA转染入原代培养星形胶质细胞中并实现AQP4基因的沉默,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA即可达到理想的沉默效果。

脂质体转染TRPM7 siRNA对肝星状细胞系HSC—T6细胞增殖的影响

目的：通过利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调TRPM7基因的表达，研究TRPM7对大鼠肝星状细胞系HSC—T6细胞活化、增殖的影响。

NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的观察针对HIF1α的SRNA表达载体GenesiI-HIF1α与阳离子脂质体复合物对HEPQ-2细胞增值及其对HIF1α表达的影响。方法以poenesil表达载体分别设计阳性对照（pG—shPJqkHif-1α），阴性对照（pG—shPNA—HK），未处理细胞为空白对照（KB）。用3μg：15μl配比的pGenesil—SlaNA-1α阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞，G418400mg／ml培养转染后的细胞10天，拍荧光照片。37℃、5％CO2S、5％C2、90％N2培养36小时，用RT—PcR测定HIF-1α mENA的表达，用cck-8测细胞增殖。结果培养36小时的阳性对照组Hif-1αmENA表达明显减低（P〈0.05），对Hepg一2细胞增殖抑制作用明显（P〈005）；结论3μ：15μl计量配比组pGenesil—hif—1α与阳离子脂质体复合物可以有效转染Hepg-2细胞，能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1α的表达，并抑制其增殖。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素

阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的基因载体。简要介绍了阳离子脂质体的结构特点;着重讨论了阳离子脂质体作为基因载体时介导基因转移的机制以及在转染过程中对基因转染效率产生影响的主要因素。

奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究

为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景:基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料:质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法:首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果:Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。

多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的评估四种多聚胺阳离子脂质体的转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体。方法多聚胺阳离子脂质TC-Chol、DC-Chol与中性磷脂DOPE分别以1：1、3：1摩尔比制备多聚胺阳离子脂质体，转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞、Hep2细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，筛选出高效的阳离子脂质体，通过MTT法检测转染细胞毒性，从而筛选相对高效低毒的阳离子脂质体。结果所制备的多聚胺阳离子脂质体在透射电镜下呈圆形、椭圆形囊泡样结构，少数呈管状、不规则状，粒径50-200nm，可将质粒PIRES2-EGFP有效转染入Hela细胞、Hep2细胞，其中多聚胺阳离子脂质TC-Chol与DOPE以3：1摩尔比制备的多聚胺阳离子脂质体是一种相对高效低毒的阳离子脂质体，转染效率39．5％～42．1％。结论多聚胺阳离子脂质TC-Chol、DC-Chol与中性磷脂DOPE以一定的摩尔比可制备高效低毒的多聚胺阳离子脂质体，其转染效率和细胞毒性与阳离子脂质的结构和中性磷脂DOPE的比例有关，在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的应用前景。

脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒RNA转染人肝癌细胞中的应用效果比较

目的：比较脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒（ HCV ） RNA转染人肝癌细胞中的应用效果。方法培养人肝癌细胞Huh7．5-CD81并分为A、B组及对照组。 A组采用电转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；B组采用脂质体转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；对照组采用脂质体转染复制缺陷质粒pJFH1／GND转录获得的HCV RNA。光学显微镜下观察各组转染后细胞形态，采用免疫荧光法（ IFA）检测三组转染效率，real-time PCR法检测三组细胞培养液上清中的HCV RNA，采用TCID50法检测A、B组细胞培养液上清中的丙型肝炎病毒（HCVcc）感染滴度。结果 A组转染使用细胞数为1×106，转染后第2天细胞损伤过半，边缘毛糙；B组转染使用细胞数为2×105，转染后第2天细胞基本无损伤。 A组转染效率为9．98％±0．83％，B组转染效率为2．58％±0．39％，两组转染效率相比，P＜0．01；对照组未检出荧光阳性细胞。 A、B组转染后细胞培养液上清中HCV RNA拷贝数均呈现先下降后升高的趋势，最终稳定于106 copies／mL。 A组转染后21 d、B组转染后31 d方能检测到HCV感染滴度，A、B组收获HCV最高感染滴度均为104 ffu／mL。结论脂质体转染和电转染两种方法均可建立嵌合HCV的人肝癌细胞培养体系，脂质体转染法对细胞的损伤较小，电转染法转染效率较高、收获HCVcc的时间较短，但两种方法收获的HCVcc感染滴度无明显差异。

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

目的比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子VEGF165基因转染人胚肾细胞293T的转染效率,为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同N/P比值的PEI将合成的含有绿色荧光蛋白(GFP)和VEGF165的质粒转入293T细胞。转染24h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性;转染48h后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率,并通过ELISA方法检测细胞上清液中VEGF165浓度,比较两种方法的转染效果。结果当N/P=9时,PEI转染的细胞活性与脂质体转染相近,对细胞的毒性较小;此时,PEI转染效率与脂质体也相似,均可达到约70%;同样,转染后细胞上清中VEGF165浓度较未转染组提高(P<0.05),但两种方法转染组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PEI作为一种新型的转染试剂,与脂质体相比,在一定比例范围内,具有转染效率高,对细胞毒性小且价格低廉的优势,有望成为基因转染的有效载体。

基因转染的pH敏感脂质体的最优处方和制备工艺的研究

目的 寻找用于基因转染的pH敏感脂质体的最佳处方和制备工艺。方法 采用正交设计法 ,考虑制备的pH值、组成摩尔比、制备方法三因素 ;即 1个四水平因素和 2个二水平因素混合状态。选用L16(4 1·2 12 )正交设计表安排试验 ,各水平组合条件下 ,通过基因转染实验 ,以基因转染荧光测定值作为观测指标 ,实验重复 4次。结果 在基因与脂质体重量比为 (1∶8)时 ,组成大豆磷脂与DC 胆固醇摩尔比为 (6∶4)和在超声法制备的特定条件下 ,pH5 .4与pH7.4基因转染荧光测定值之间差别非常显著 ;均值都较大 ,但是以 pH5 .4时基因转染荧光测定值均值最大。 结论 基因转染荧光测定值最高的脂质体为在 pH5 .4、组成大豆磷脂与DC 胆固醇摩尔比为 (6∶4)时采用超声法制备的脂质体。

pEGFP-N1脂质体转染方法的优化及其应用

目的:应用脂质体介导的转染方法将pEGFP-N1转染入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中,并获得较佳的优化方案,阐明该优化条件在转染其他目的基因时的适用性。方法:分别选取不同配比的质粒和脂质体,将pEGFP-N1转入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞。转染后36h,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率;台盼蓝染色法检测细胞存活率,以此获得优化的转染条件。同时将pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5分别以上述条件转染,并获取相应优化的转染条件。结果:在质粒质量固定的条件下,随着脂质体质量的增加,其转染效率和细胞存活率升高;但是当质粒∶脂质体>1∶4时,转染效率和细胞存活率下降。在质粒和脂质体比例固定而质量增加时,其转染效率和细胞存活率下降;当质粒∶脂质体>3.2μg∶12.8μL时,转染效率降低。应用脂质体介导的方法转染pEGFP-N1和转染pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5时,在质粒与脂质体的配比为1∶4(3.2μg∶12.8μL)时,转染效率达最高。结论:在应用脂质体介导的目的基因转染时,pEGFP-N1优化的转染条件具有较为广泛的适用性,可用作后续目的基因高效转染优化条件。

阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究

研究阳离子脂质体在不同细胞中的转染效率及毒性。首先采用DNA延滞实验研究Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂与DNA的结合能力。然后选用绿色荧光蛋白的质粒pGFP-N2作为报告基因模型和转染试剂制成复合物后转染Hela7、721、HT29细胞,比较多种因素对转染的影响。最后使用MTT比色法分析Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂对细胞的毒性。随着复合物中转染试剂比例的增加,Lipofectamine2000、DOTAP与DNA结合能力逐渐增强。Lipofectamine2000在Hela细胞转染最高效率约72%;在7721、HT29细胞转染效率较低,DOTAP在3种细胞的转染效率都很低;在转染效率最高时2种转染试剂的细胞存活率均在90%以上。对商品化的转染试剂研究和讨论以期为阳离子类脂非病毒载体的研究提供参考。