微超声波对脆壁克鲁维氏酵母菊糖酶生产的作用

微超声波在脆壁克鲁维氏酵母菊糖酶发酵生产中的应用研究表明：在２０ｋＨｚ，１０Ｗ的微超声波作用下，脆壁克鲁维氏酵母菊糖酶产量提高１倍以上。发酵条件中最适产酶ｐＨ为６．５～７．０，最适温度为３２℃，通过显微镜观察及核酸测定结果证明：这种微超声波的作用不足以使细胞产生破碎。

脆壁克鲁维酵母乳糖酶提取物性质研究

研究了脆壁克鲁维酵母菌乳糖酶的性质 ,该酶作用最适 pH在 6 5～ 7 0 ,最适温度为 37℃ ,5 0℃保温 15min残留酶活为 84 0 2 % ,该酶在 pH 5 8～ 7 3范围内比较稳定 ,以ONPG和乳糖为底物的米氏常数为1 16mmol/L和 5 6 3mmol/L ,Mn2 + ,Mg2 + ,Na+ ,K+ 及微量Ca2 +

脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立

以中性乳糖酶生产菌脆壁克鲁维酵母为材料,构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母,对受体菌生长时期、电场强度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明,以OD600为0.8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压1.5 kV、电场强度为7.5 kV.cm-1、电击后培养时间为90 min,可获得较高的转化率,最高转化效率为2.37×102转化子.μgDNA。在电击转化的同时加入限制性内切酶10μL,对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87.5%的转化子为同源重组,从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。

脆壁克鲁维酵母蛋白二硫化物异构酶KfPDI的结构分析

利用ＤＮＡ限制性内切酶图谱分析将一个带有脆壁克鲁维酵母 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ） 蛋白二硫化物异构酶基因（ＫｆＰＤＩ） 的１０ ｋｂ 初始克隆缩短为４ ｋｂ 的亚克隆，并测定了该基因的ＤＮＡ全序列。经分析发现： （１）该基因编码产物由５２０个氨基酸残基组成。（２） 它与乳酸克鲁维酵母（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ） 蛋白二硫化物异构酶在氨基酸序列上的同源性为７８。（３） 它与其他物种的ＰＤＩ基因在核苷酸和蛋白质水平上的同源性较弱，

人凝血因子IX在脆壁克鲁维酵母中的表达与分泌

通过改造人凝血因子IX基因(h-FIX)使其与乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的分泌信号序列(Kss)融合,并置于脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LAC4基因调控型启动子的控制之下,构建成h-FIX基因表达盒。将此表达盒插入克鲁维酵母的整合质粒,得到了一个高稳定的h-FIX基因整合表达载体pHKB202-FP。经摇瓶培养并以半乳糖诱导此表达载体转化的酵母菌株,ELISA检测显示酵母上清液中的人凝血因子IX表达量可达到约200 ng/ml。此结果表明人凝血因子IX蛋白首次成功地在脆壁克鲁维酵母中得到了表达和分泌。这对于促进人凝血因子IX的基因工程产业化具有实际意义。

脆壁克鲁维酵母KfPDI基因高表达菌株的构建

通过构建脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromycesfragilis)蛋白二硫化物异构酶基因KfPDI强表达单元并克隆到不同类型的酵母载体上转化酵母菌株 ,经筛选得到了带有不同拷贝数KfPDI基因的酵母转化子。酶活性测定结果表明这些转化子中的蛋白二硫化物异构酶表达水平不仅与其KfPDI基因拷贝数有关 ,而且与该基因是否整合入宿主染色体也密切相关。

脆壁克鲁维酵母乳糖酶的提取与发酵优化

通过试验研究了一株脆壁克鲁维酵母胞内乳糖酶的破壁提取及其发酵培养基成分与培养条件优化,确定了该株酵母合适的破壁方法及最佳发酵培养条件。结果表明,采用球磨机对该酵母进行处理可以较好地释放胞内乳糖酶。其发酵生产乳糖酶的最佳培养基成分为:乳糖4%,酵母粉3%,MnCl21mol/L;最佳培养条件:接种量10%,温度28℃,初始pH7～7.5,摇床转数180r/min,培养时间36h。在此条件下培养,乳糖酶活力达1100U/mL,4140U/g干菌体。

脆壁克鲁维酵母生产乳糖酶发酵条件的优化

通过试验研究了一株产乳糖酶脆壁克鲁维酵母的发酵培养基成分及培养条件,最终确定了该株酵母的最佳发酵培养条件。结果表明,此株脆壁克鲁维酵母发酵生产乳糖酶的最佳培养基成分为:乳糖4%,酵母粉3%,MnCl21mmol/mL;最佳培养条件:接种量10%,温度28℃,初始pH7-7.5,摇床转数180r/min,培养时间36h。在此条件下培养,乳糖酶活力达1100u/mL或4140u/g干菌体。

脆壁克鲁维酵母KfADE5,7基因的克隆及其5’非编码区结构与功能研究

通过补偿乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)KlADE5,7基因突变,从脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)基因组文库中克隆了KfADE5,7基因。该基因全长4975bp,编码793个氨基酸,氨基酸序列与已知的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ScADE5,7基因编码区有68.3％的同源度。利用KfADE5,7-lacZ融合基因,对5’非编码区进行缺失分析,发现了具有完整启动子功能的区域,在启动子上游还发现了两个增强转录和两个减弱转录的区域。

Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺,系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶。K.fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K.fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的HiprepR16/10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26/60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化,酶的回收率为27%,纯化倍数为42。纯化的K.fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,呈现一条染色谱带,表明纯化的酶具有较高的纯度。K.fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60000。

脉冲磁场对Kluyveromyces fragilis生长及菊糖酶合成的影响

研究了脉冲电磁场对Kluyveromycesfragilis细胞生长和菊糖酶生物合成的影响.结果发现:94Hz,14mT,脉宽为1300μs,间歇时间为8700μs,上升和下降时间为200μs的矩形脉冲磁场的作用使菊糖酶活力提高了23%.这种脉冲电磁场对酶的诱导合成作用使菊糖酶的合成总量是对照样的136%.同时发现这种作用使对应菊糖酶mRNA合成量增大,而且菊糖酶mRNA合成量增大与菊糖酶生成量的增加相关.可以认为脉冲电磁场促进了Kluyveromycesfragilis菊糖酶基因的转录与表达.

脆壁克鲁维酵母LAC4基因的克隆与表达

在大肠杆菌有E.coli TG1中构建了脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis,CBS 397)的基因文库,并通过补偿乳酸克鲁维酵母(K.lactis)lac4-8突变,从该文库中获得了5个β-半乳糖苷酶基因(LAC4)克隆.对该基因结构与功能的初步研究结果表明:(1)该基因也能补偿大肠杆菌的lacZ突变;(2)脆壁克鲁维酵母LAC4基因与乳酸克鲁维酵母LAC4基因的物理图谱非常相似;(3)克隆株产生β-半乳糖苷酶的水平明显高于原始菌株;(4)不同克隆株之间受乳糖或半乳糖诱导表达β-半乳糖苷酶水平的差异与该基因5＇端非编码区结构保留的程度有关;(5)在LAC4基因5＇端非编码区可能存在一个乳糖特异的转录激活区域.

酵母菌药用乳糖酶制备新方法

目的 :建立一种简易的从酵母菌制备克鲁维酵母乳糖酶的方法。方法 :在 3 0L发酵罐中进行发酵 ,用对羟基苯甲酸酯进行细胞破壁 ,用超微过滤方法浓缩破壁液。结果 :乳糖酶的收率可达到每毫升发酵液含11 4ONPG单位。从酵终细胞中释放乳糖酶可达 70 % ,每毫升牛奶中加入 1 2ONPG单位制备的液态乳糖酶可使牛奶中的乳糖水解率达到 70 %。

碳源对K.fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromycesfragilis)LFS 86 11生长、β D 半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母 (K .fragilis)LFS 86 11生长与 β D 半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖 ,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加 ,乳糖浓度为 12mg/mL ,菌体生物量和酶活力达到峰值 ,分别为 5 .84 g/L、19.12U/mL。半乳糖和乳糖对 β D 半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β D 半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K .fragilisLFS 86 11细胞合成β D 半乳糖苷酶的最适浓度为 10mg/mL。

食品上的应用

建立了描述脆壁克鲁维酵母NRS5790在千酪乳清好气培养生产单细胞蛋白过程中生长和死亡的的数学模型。此模型可确定滞后、指数。