木薯脆性胚性愈伤组织原生质体培养与植株再生

【目的】建立有效的木薯原生质体再生体系,为原生质体融合以及原生质体转化等研究奠定技术基础。【方法】酶解木薯品种TMS60444的脆性胚性愈伤组织(FEC)的悬浮系,分离原生质体的产量最高达3.5×106个/g,FDA检测其活性约90%。用TM2G培养基以液体浅层法分别在5×105个/mL和2×105个/mL密度下培养,培养过程中前30 d用0.3 mol.L-1TM2G新鲜培养基每10 d更换1次,此后每10 d用0.25 mol.L-1TM2G新鲜培养基更换。原生质体培养45 d后即可挑出1—2 mm大小的愈伤组织分别在MSN培养基上分化胚、CMM上促胚成熟、CEM上茎伸长、MS上生根。【结果】在5×105个/mL的原生质体培养密度下,长出的都是致密型愈伤组织(能分化胚状体),而在2×105个/mL的密度下培养长出的有致密型愈伤组织,也有空泡型愈伤组织(不能分化胚状体)。本试验共挑出1 479个致密细胞团,分化获得757个子叶胚,已再生完整植株186棵。【结论】本研究分离的原生质体产量和活性有较大提高,对前人所指出的瓶颈问题有所改进,原生质体再生植株效率有较大提高。

外源褪黑素对木薯脆性胚性愈伤组织增殖的影响

以木薯(Manihot esculenta)‘TMS60444’脆性胚性愈伤组织(FEC)为材料,研究了在GD基础培养基中添加不同浓度外源褪黑素(melatonin)对FEC增殖的影响。结果表明:在不含氨氯吡啶酸(4-氨基-3,5,6-三氯吡啶-2-羧酸)的GD培养基(GD0)中加入不同浓度褪黑素,其中低浓度(<100μmol·L^(-1))褪黑素可以促进FEC增殖,但高浓度褪黑素使FEC生长缓慢并褐化。在含有12 mg·L^(-1)氨氯吡啶酸的GD培养基(GD1)中添加不同浓度褪黑素(0、0.1、1、10、100μmol·L^(-1))进行培养,FEC鲜重增长率明显不同;以添加10μmol·L^(-1)褪黑素效果最佳,可使FEC保持较好的增殖状态,并显著提高木薯FEC鲜重的增长率,比不加褪黑素的GD1-1培养基中增加了2.57倍。用10μmol·L^(-1)褪黑素处理木薯FEC,其内源褪黑素代谢通路相关基因表达发生改变,抗氧化相关基因明显上调表达;并且抗氧化酶活性显著增强,抗氧化能力明显提高。本研究为木薯遗传转化中延长木薯FEC使用周期和提高增殖效率提供思路和技术。

Mechlppdk基因在木薯中的表达分析及RNA干扰载体构建和遗传转化

本研究为了明确丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)在木薯中的表达谱,创制Mechlppdk的干扰株系,以期为Mechlppdk的功能研究提供材料。本研究以栽培型木薯Arg7为材料,用qPCR的方法分析Mechlppdk在木薯根、茎、叶中的表达谱;采用RNA干扰的方法,构建Mechlppdk的干扰载体,并遗传转化木薯脆性愈伤,经木薯再生体系获得转基因苗,在添加抗生素的培养基上进行生根筛选,经PCR鉴定获得Mechlppdk的干扰株系。用qPCR的方法鉴定Mechlppdk在干扰株系的表达情况。结果表明,Mechlppdk在木薯叶片中表达量最高,达到管家基因的50%。在Mechlppdk的转运肽区,选取1个保守区段设计引物,构建RNA干扰表达载体pART27-Mechlppdki,将表达载体转化农杆菌LBA4404,侵染木薯脆性胚愈伤,获得阳性转基因木薯苗7个株系。通过qPCR分析发现各株系Mechlppdk转录本有不同程度的降低。通过以上分析表明本研究获得了干扰效率较高木薯Mechlppdk干扰株系,将为解析木薯Mechlppdk的功能提供研究材料。

木薯再生体系建立的研究进展

木薯是一种重要的粮食和工业原料作物。随着细胞工程和基因工程的发展,生物技术育种要求一种高效的再生体系。从木薯的器官发生途径、体细胞胚发生途径、脆性胚性愈伤组织(FEC)再生和原生质体再生4个方面阐述了木薯再生体系的发展与建立,以期为木薯组织培养和基于木薯再生体系的技术进步提供参考。

影响木薯原生质体再生植株的因素

原生质体培养和植株再生技术是植物细胞工程、基因工程的基础。木薯是一种重要的粮食作物和工业原料作物。木薯原生质体再生植株是一种重要的组织培养再生手段。本文是在已建立的木薯原生质体再生体系的基础上,总结归纳了原生质体再生过程中的重要影响因素,也是木薯原生质体整个再生过程中的重点和难点,分享了原生质体再生过程中的一些经验和小技巧,为木薯原生质体再生提供技术指导,为木薯组织培养提供有益的启发与参考,也为生物技术改良木薯品种奠定基础。