柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer®RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C.paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C.paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P.trifoliata×C.sinensis)、枣阳小叶枳(P.trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒(pea enation mosaic virus)和紫花苜蓿耳突病毒(alfalfa enamovirus)的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株(阳性率)分别为16/17(94.12%)、12/14(85.71%)、16/21(76.19%)、15/19(78.95%)、13/14(92.86%)和0/18(0)。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。

浙江黄岩柑桔脉突病毒病的发生与生物学鉴定

在浙江黄岩桔区一些商品化柑桔品种和杂种如本地早、早桔、木曼桔、少核本地早、柑、温州蜜柑、朱红、乳桔、北京柠檬、华盛顿脐橙和红玉柑等的田间植株的叶片上观察到由柑桔脉突病毒（ＣＶＥＶ）引起有特征性的叶脉突起症状。通过兰卜来檬、墨西哥来檬、巴西酸橙、代代酸橙、粗柠檬和本地早等指示植物实生苗的嫁接接种，以及用无毒株心系的伏尔默柠檬芽高接到田间病树等方法，在上述品种的植株上出现柑桔脉突病毒症状。生物鉴定的潜育期较长，一般需６～８周以上。

柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng^(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。

柑桔脉突病研究进展

柑桔脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV)引起的柑桔脉突病是一种危险性柑桔病害。该病可侵染大多数柑桔种类,且对以粗柠檬、兰普来檬等做砧木的柑桔幼苗影响较大,造成植株树势衰弱,生长减缓。为增进对该病的认识,根据国内外的研究报道,对CVEV的分类地位、生物学和分子生物学特性进行了总结,并介绍了CVEV的检测技术和防治方法。