离子交联海藻酸盐水凝胶在细胞培养和冷冻保存中的研究

近年来,水凝胶在细胞和类器官培养和冷冻保存方面表现出显著优势,尤其在细胞冷冻保存方面。在该研究中,选用喷雾法,以三价铁和钙为交联剂,采用低成本且易获得的喷枪制备了海藻酸钙和海藻酸铁水凝胶,并用该方法包封了HEK293T细胞和HepG2细胞,研究了不同交联液对包封细胞时细胞存活率的影响,发现交联时间越长对细胞损伤越大,与海藻酸钠溶液交联后发现凝胶后降低了细胞在交联液中的损伤。还制备了不同质量分数海藻酸钠溶液(1%、1.5%、3%)与CaCl_(2)(0.2 mol/L)交联的水凝胶,包封HEK293T细胞并培养7 d,发现细胞均可以很好地在水凝胶中培养。最后,研究了包封后细胞冷冻保存的存活率,结果表明:HEK293T细胞和HepG2细胞在两种体积分数的二甲基亚砜(DMSO)为保护剂的前提下存活率均显著高于未包封组,包封前HEK293T细胞的存活率为33.16%±2.70%(10%DMSO)和16.75%±2.3%(5%DMSO),而包封后的细胞存活率增至76.51%±5.32%(10%DMSO)和60.86%±2.41%(5%DMSO)。对于HepG2细胞,细胞存活率则从包封前的48.93%±3.06%(10%DMSO)和36.22%±2.54%(5%DMSO)增至包封后的78.79%±4.43%(10%DMSO)和64.64%±3.13%(5%DMSO)。在乙二醇(1 mol/L)+丙二醇(1.5 mol/L)+海藻糖(1 mol/L)作为保护剂的前提下,玻璃化保存的HEK293T细胞的存活率由包封前的33.5%±0.8%增至79%±3.76%。数据表明,冷冻保存后包封细胞的存活率明显高于未包封细胞,离子交联海藻酸盐水凝胶可以在细胞冷冻保存中保护细胞。

壳聚糖－海藻酸盐微囊对尼莫地平的缓释作用

壳聚糖－海藻酸盐微囊对尼莫地平的缓释作用卢凤琦曹宗顺王春香米广太吴俊帽（济南２５００１２山东医科大学药学系）甲壳素是一种天然多糖，壳聚糖是其脱乙酰基衍生物，无毒无味，可以生物降解，作为新型制剂辅料正受到人们的重视。我们用复凝聚法制备了壳聚糖－海藻酸盐...

微囊内残余海藻酸钠对微囊化大鼠肝细胞功能的影响

生物人工肝治疗急性肝功能衰竭简单方便,其中确保肝细胞的功能是关键.采用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化技术包被肝细胞既能阻隔免疫反应,囊内细胞呈球状生长符合肝细胞的生长状态,是人工肝有应用前景的细胞之一.但微囊内残余海藻酸钠在成囊后不能很快排出,对肝细胞功能的影响研究较少,故进行探讨.

海藻酸盐小球中培养的软骨细胞的生长

目的为海藻酸盐水凝胶作为软骨细胞三维培养环境提供实验依据。方法将酶消化法获取的P1代软骨细胞包裹在20 g/L海藻酸钙凝胶小球中持续培养4周,在培养的不同时间点取适量的小球行倒置相差显微镜观察,HE、番红"O"染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色;并通过MTT法检测细胞活性及增殖;二甲基亚甲兰法进行氨基葡聚糖(GAG)含量测定。结果在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞增殖逐渐聚集成簇;细胞外基质沉积逐渐增加,GAG含量增多。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。结论软骨细胞在海藻酸盐凝胶小球中培养有效维持了细胞的分化状态,细胞增殖并具有良好的分泌蛋白功能。海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。

长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。

海藻酸盐支架-骨髓间充质干细胞复合物在急性肝衰竭大鼠体内的应用

目的:探讨海藻酸盐支架-骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合物在急性肝衰竭大鼠体内应用的可能性,为人工肝组织的体内应用提供基础。方法:BMSCs用氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-DiI)标记后种植于海藻酸盐支架形成支架细胞复合物。动物分实验组和对照组,构建70%肝切除大鼠模型,实验组大鼠给予支架细胞复合物平铺于肝脏创面上,对照组给予单纯支架。4周后取出支架细胞复合物行荧光显微镜追踪观察;切片行白蛋白及糖原染色追踪支架上细胞的分化;同时比较两组大鼠生存率及肝功能变化情况。结果:CM-DiI能很好地标记细胞。体内应用后BMSCs能够在海藻酸盐支架上分泌白蛋白,合成糖原。实验组大鼠的生存率及肝功能改善情况优于对照组。结论:海藻酸盐支架-BMSCs复合物在急性肝衰竭大鼠体内能够起到部分肝功能支持的作用。

海藻酸盐结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核模型的力学性能

背景:外科手术是治疗脊柱结核的重要手段。但考虑脊柱位置的特殊性,承受机体应力及需拆除内固定所致二次损伤是外科治疗的局限所在。组织工程为各种疾病的治疗带来了新的思路和希望。理想生物材料代替传统内固定材料,具有明显无毒害及明显免疫排斥反应。目的:探究海藻酸盐结合骨髓间充质干细胞修复脊柱结核的力学性能。方法:将40只新西兰兔等分为对照组、脊柱结核组、海藻酸盐组与钛合金组。对照组不予以任何处理,其他组于L_5近椎间盘处钻孔填充明胶海绵,注射结核菌混悬液0.1 mL(菌量5 g/L),建立脊柱结核模型。2个月后,后2组模拟L_(4-5)脊柱结核切除,植入复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料和钛合金内固定材料。结果与结论:钛合金组1只新西兰兔出现局部感染、红肿;海藻酸盐组未出现局部感染、红肿等不良反应。海藻酸盐组及钛合金组前屈、后伸及侧弯距离及最大轴向拔出力均优于脊柱结核组,均接近于对照组。结果说明复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后与机体生物相容性较好,且复合骨髓间充质干细胞的藻酸盐凝胶材料植入后脊柱稳定性与钛合金接近,具有良好的脊柱稳定性。

海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹杂交瘤细胞的研究

目的 对海藻酸钠 聚左赖氨酸 海藻酸钠 (APA)微囊包裹杂交瘤细胞进行初步研究。方法 用人IgG1 免疫小鼠 ,取免疫后脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2 0细胞融合 ,获得分泌抗人IgGκ链单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,命名为JY A1;通过优化制备条件 ,制备包裹杂交瘤细胞的APA微囊 ,并考察形态学 ;比较不同微囊膜的机械强度和化学强度 ;用ELISA法测定mAb的释放。小鼠腹腔注射微囊 ,不同时间回收观察。结果 相同条件下制得的微囊粒径均匀、表面光滑。体外培养条件下mAb能持续透过微囊膜。小鼠腹腔注射微囊后无异常 ,回收的微囊大部分形态完整。结论 采用高压静电成囊技术制备的APA微囊具有较高的膜强度 ,对细胞分泌产物mAb能持续稳定释放 。

脉络丛细胞微囊脑内移植前后的物理及生化性能研究

通过测定脉络丛细胞海藻酸盐微囊在大鼠脑内移植前及移植后的物理及生化性能变化,以探讨其应用于移植治疗神经系统疾病的可行性.用海藻酸盐多聚鸟氨酸微囊包裹猪脉络膜细胞,移植至大鼠黑质-纹状体通道,移植前、移植后4个月及6个月分别测定微囊的大小、形态及细胞的活力、分泌蛋白质及神经营养因子的能力、蛋白质组学的变化.脉络膜细胞微囊在移植前、后大小、细胞活力、蛋白质组学分析、分泌蛋白质及神经营养因子的能力无显著变化.海藻酸盐-多聚鸟氨酸CP微囊能有效地防止脉络膜细胞被受体免疫系统所攻击,使得它们能在大鼠的大脑存活6个月以上并不引起不良作用.

聚乙烯醇/海藻酸盐-胶原生物打印小口径人工血管的制备及内皮化性能

目的 聚乙烯醇/海藻酸盐(Polyvinyl alcohol/Alginate,PVA/Alg)生物打印小口径血管具备良好的力学性能和生物相容性,其分子结构中大量的羧基和羟基,使血管表面呈现出较好的亲水性和抗凝作用,为临床小口径血管的应用提供了可能性。但是,PVA/Alg小口径生物打印血管内皮化效果以及流体剪应力作用下内皮细胞的结构和功能变化仍需进一步探究。因此,本课题旨在利用明胶(gelatin,Gel)的良好生物相容性,构建PVA/Alg-Gel生物打印小口径血管,并探讨不同剪应力下功能化PVA/Alg-Gel血管内皮化效果。方法 采用PVA/Alg-Gel为生物墨水,利用生物打印技术同轴打印PVA/Alg-Gel小口径血管,进行力学和生物学性能检测,构建体外血管应力培养装置,探究不同的流体剪应力对PVA/Alg-Gel血管内皮化的形成规律,并利用体内验证内皮化PVA/Alg血管促血管再生能力。结果PVA/Alg-Gel(8/1-1)小口径血管表现出良好的血管顺应性;Gel的良好生物相容性,增强了内皮细胞的黏附性。体外流体剪应力作用下内皮细胞形态、分布、排列呈现出规律性。结论 同轴打印技术制得的PVA/Alg-Gel小口径血管具备良好的力学性能,很大程度上提高了血管顺应性,动态流动的血流有利于内皮细胞成对齐方式排列,有希望应用于临床移植术中。

一种固定化酵母细胞的复合载体——PVA-海藻酸盐凝胶

固定化细胞这一生物技术在近20年来发展迅速,已涉及食品、发酵、化工、医疗、生化等各领域.新型载体研制是发展固定化细胞技术的一个主导因素.PVA(聚乙烯醇)是近年来用于固定化细胞的一种新载体材料,但目前制备PVA凝胶的方法通常是在PVA溶液凝固后(或加入固化剂、乳化剂等让其凝固)手工切块.为了解决PVA载体的成球问题,简化制备方法,我们进行了这方面的研究.本文报道了用PVA和海藻酸钠制备的一种固定化细胞载体新配方,比较了几种常用载体及几种PVA载体的性能及用于乙醇发酵的实验结果.

用海藻酸盐和胶态硅固定细胞和酶

由海藻酸盐和胶态硅(Colloidal Silica)所制备的凝胶即AS胶可用于固定酶和微生物。

海藻酸盐-多聚赖氨酸-海藻酸盐微胶囊膜的强度和生物相容度测定

目的 :了解我们所制作的海藻酸盐 多聚赖氨酸 海藻酸盐 (APA)微囊的生物相容性、机械和化学强度。方法 :用静电微囊发生器制作海藻酸盐 多聚赖氨酸 海藻酸盐的APA微胶珠及枸橼酸钠液化微珠芯的APA微胶囊。用振摇法比较微囊与微珠的机械强度。用不同酸碱度溶液测定微囊的化学强度。用微囊小鼠腹腔移植法观察APA微囊的生物相容度。结果 :①机械振摇 48h的破损率 :微囊为 5 % ;微珠为 31% ;②Ph 7 4对APA微囊的化学损伤最小 ;③移植后 1周、2周、4周、8周和 10周从小鼠腹腔内取出的微囊 95 %～ 98%为完整、圆形、表面光滑、无明显的结缔组织包绕。结论 :我们所制作的APA微囊具有较好的生物相容度。

组织工程医疗器械产品海藻酸盐凝胶固定或微囊化指南

本标准规定了海藻酸盐凝胶固定或微囊化评价的要求,包括海藻酸盐凝胶固定或微囊化、微胶囊或微胶珠的性能及其考察、海藻酸盐凝胶的生物相容性的考察.

骨髓基质细胞在藻酸盐凝胶中的生物学行为

目的 :探讨骨髓基质细胞 (BoneMarrowStromalCells ,MSC)在海藻酸盐 (Alginate)中的生物学行为 ,为在组织工程研究中选用海藻酸盐做为骨髓基质细胞的载体提供理论依据。方法 :将地塞米松诱导后的骨髓基质细胞种植在1%海藻酸盐中 ,以HE染色、BMP 2免疫组化染色、扫描电镜观察骨髓基质细胞在凝胶中的生物学行为。结果 :凝胶中细胞呈“悬浮”生长状态 ,可见到细胞分裂和核分裂相 ;细胞在凝胶中增殖 ,4d后可以见到基质分泌 ;海藻酸盐中培养组与常规培养组MSC的BMP 2阳性表达率无显著差异。结论 :在海藻酸盐中骨髓基质细胞的生物学行为表现良好 。

明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤

背景:软骨损伤的微创治疗对于微载体的要求较高,需要其有较高的细胞相容性、较强的细胞黏附力、较好的力学性能与低免疫原性。同时,临床使用条件相比实验室更加苛刻,在微创或注射使用微载体时液态微载体要明显优于固态微载体。目的:制备一种全新的高分子有机微载体,以用于修复软骨缺损。方法:通过明胶与液体石蜡(W/O)混合搅拌的化学乳化法制备浓度为6%的明胶微球,冻干后用无水乙醇处理固定,再使用紫外交联法固定,电镜观察微球形态。配置浓度为7%的海藻酸钠凝胶,与明胶微球混合孵育2 h,制备明胶-海藻酸盐复合凝胶。将脂肪间充质干细胞悬液滴入明胶-海藻酸盐复合凝胶中孵育24 h,滴入5%CaCl_(2)溶液中充分交联,制备含细胞明胶-海藻酸盐复合微球。采用CCK-8法检测无细胞明胶-海藻酸盐复合微球浸提液的细胞毒性;利用死活染色观察含细胞明胶-海藻酸盐复合微球的细胞活性;将约1 mL明胶-海藻酸盐复合凝胶吸入10 mL针管进行注射,对未注射与注射1,3次的凝胶进行光镜观察。结果与结论:①扫描电镜下可见,明胶微球孔隙相对均一且表面有层次感,微球粒径大多分布在180-500μm之间;②死活染色显示,培养24 h含细胞明胶-海藻酸盐复合微球中的细胞生长良好,携带细胞数量多且分布均匀,培养1,3,7 d后的细胞活性均在90%以上;③CCK-8检测显示,无细胞明胶-海藻酸盐复合微球浸提液无明显的细胞毒性;④与未注射时相比,注射1,3次后明胶-海藻酸盐复合凝胶中的明胶微球形态无变化,显示明胶-海藻酸盐复合凝胶体力学性能良好;⑤结果表明,联合使用含细胞明胶-海藻酸盐复合微球及含细胞明胶-海藻酸盐复合凝胶可使凝胶发挥组织胶的作用,利于材料紧贴目标区域。

骨髓间充质干细胞-海藻酸钠凝胶治疗脊髓损伤的实验研究

目的:研究不同方法配制的海藻酸钠凝胶,对骨髓间充质干细胞的生物学功能的影响及其作为生物相容性载体在脊髓损伤后干细胞治疗中的作用。方法:分别以去离子水和生理盐水为溶剂,采用固态高压蒸汽灭菌和液态高压蒸汽灭菌两种方法,配制浓度为1%和5%及10%的海藻酸钠凝胶;原代分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),用海藻酸钠凝胶孵育,在不同时间点用MTT法检测细胞的活性;建立小鼠脊髓全横断模型,将包被有mMSCs的海藻酸钠凝胶填充断端,术后2周内进行后肢运动功能评分(Basso Mouse Scale,BMS);术后第14天取损伤段脊髓组织进行免疫荧光染色,观察神经丝(NF-200)的表达与分布情况。结果:用去离子水配制的海藻酸钠凝胶较之生理盐水组有更好的溶解度;MTT实验显示,固态高压蒸汽灭菌法配制的浓度为10%的海藻酸钠凝胶能显著提高mMSCs的细胞活性,用该方法配制的凝胶包被mMSCs填充小鼠损伤脊髓断端,发现该组小鼠从第3天起2周内的BMS评分明显高于对照组;且其断端组织的NF-200表达高于对照组。结论:用固态高压蒸汽灭菌法制备的海藻酸钠凝胶促进mMSCs的活性,是脊髓损伤干细胞移植治疗中的良好载体。

海藻酸盐基生物医用材料

目的:海藻酸盐基生物医用材料是一种多形式且多功能性物质,为推动该物质的广泛且有效地临床应用,以综述的方式全面评述其结构与功能、制备与应用。资料来源:采用计算机检索Medline 2004-01/2006-12关于海藻酸盐的文章。检索词“alginate,microcapsule”并限定文章的语言种类为English。同时利用计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2006-12的相关文章,检索词为“海藻酸,微囊”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审核,纳入标准:①关于海藻酸盐基生物医用材料的结构和功能。②对其生物相容性的研究等。排除标准:重复性研究。资料提炼:共收集到符合上述要求的文献76篇,排除重复性研究21篇。55篇符合纳入标准:其中25篇关于海藻酸基生物医用材料的结构和功能,30篇关于生物相容性研究。资料综合:从海藻酸盐基生物医用材料的结构与功能、产品标准、微囊、栓塞剂及其生物相容性等5个方面综合述评。①海藻酸不同的组成成分及其不同的结构和构象表现出凝胶化性能、金属离子螯合性能、生物学性能。②海藻酸微囊的制备目前常用的是与人工合成的阳离子聚合物--聚赖氨酸藉单凝聚法或/和复凝聚法。近年来尝试采用壳聚糖代替或修饰制备海藻酸微囊,其制备方法温和、简单、成囊速度快,其微囊球性度和光洁度好,药物稳定性好且利用度高。现已将海藻酸盐微囊化应用于细胞、疫苗、蛋白质及药物中。③海藻酸盐栓塞剂由于其生物相容性好,靶向栓塞定位好,栓塞球大小易控而且质量稳定等优点,现已应用于原发性肝癌和子宫肿瘤的治疗中。④海藻酸囊化材料不仅要与囊化供体组织细胞相容,而且还与宿主环境中的组织及免疫系统相容。结论:海藻酸盐独特的性能赋予其能安全地用于人体,而且在用于药物缓释和再生医学方面还有很大的发展空间。

海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用:持续、动态与顺序释放

背景:海藻酸盐可以改善创面敷料的亲水性质、创造湿润的创面微环境、清除创面渗出物。目前,海藻酸盐生物高分子材料已被应用于多种创面敷料的设计和开发,以提高创面愈合的效率。目的:总结海藻酸盐基水凝胶/敷料在皮肤创面愈合中的研究及进展。方法:应用计算机检索2000至2020年PubMed、Science Direct和CNKI等数据库中的相关文章,英文检索词为“Alginate hydrogel,Wound healing,Wound dressing,Mesenchymal stem cell,Growth factor,Nanoparticles,Diabetic wound,Antibiotics,Bioactive peptide,threedimensional printing”,中文检索词为“海藻酸盐、创面修复”。根据纳入与排除标准最终保留60篇文献进行综述。结果与结论:①海藻酸盐与其他有机或无机材料发生交联可提高复合材料的机械性能和生物降解性,创造湿润温和的创面微环境;②海藻酸盐基水凝胶/敷料可以作为传递平台负载种子细胞、生长因子或其他生物活性物质,加快创面愈合的速度;③如何使海藻酸盐材料具有较多的细胞识别位点,如何改善复合支架材料的力学性能,如何控制海藻酸盐生物材料的微观结构及如何控制药物或细胞的动态释放、持续释放和顺序释放等问题,仍需研究者们进一步探索。

微囊化大鼠胰岛细胞的冷冻保存

目的探讨海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊在胰岛细胞冷冻保存过程中的作用。方法将分离纯化后的大鼠胰岛细胞分为微囊化组和游离组。经冷冻保存1月后在RPMI 1640中培养过夜,分别测定两组的胰岛细胞回收率、胰岛细胞直径并进行胰岛素刺激释放试验。结果微囊组胰岛细胞回收率为98．2％±1．4％,较游离组71．6％±2．9％显著提高 (P<0．05)。在高糖(16．7 mmol／L)刺激下,微囊组胰岛素分泌量较游离组高(22．6±1．8 mU/Lvs 11．7±1．5 mU/L,P<0．05)。在含有茶碱的高糖溶液中,微囊组的刺激指数为游离组的3倍。结论海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊可显著提高胰岛细胞冷冻保存后的回收率,并改善胰岛细胞的功能。