葛根素对脉络膜血管内皮细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度葛根素(Puerarin,Pur)对体外培养脉络膜血管内皮细胞(Choroidal vascular endothelial cells,CVECs)增殖的影响。方法:取第3代人CVECs用于实验。实验组中加入含不同浓度的Pur培养液,细胞对照组加入等量空白培养液。24 h及48 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测血管内皮细胞的增殖情况。结果:与细胞对照组比较,0.05、0.50、5.00μg/ml和50μg/ml Pur组作用24 h及48 h后CVECs A值均增加(P<0.01)。结论:Pur对体外培养的CVECs有明显的促进增殖作用,其作用与Pur的剂量有关。

脉络膜微血管内皮细胞的培养及相关研究

脉络膜新生血管与眼部多种疾病有关 ,而脉络膜微血管内皮细胞是研究脉络膜新生血管的重要工具。目前已有数种脉络膜微血管内皮细胞体外培养体系 。

羟基红花黄色素A对高糖作用下恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞迁移及VEGF表达的影响

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)对高糖作用下恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)迁移的影响,探讨HSYA抑制脉络膜-视网膜新生血管内皮细胞的作用机制。方法采用细胞划痕修复实验和半定量RT-PCR方法,检测HSYA对正常和高糖作用下RF/6A迁移和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。结果 HSYA在183、77、3 mg/L浓度对高糖(22 mmol/L)诱导下RF/6A细胞有显著抑制作用,而对正常糖(5.5mmol/L)下RF/6A细胞无显著抑制作用;与正常糖组比较高糖组VEGF明显表达,而加HSYA组VEGF表达降低。结论一定浓度的HSYA对高糖诱导下RF/6A细胞有显著抑制作用,其可能机制为HSYA抑制血管内皮细胞VEGF表达。

人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的三维培养及血管生成拟态机制的研究

目的通过体外三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,观察其生成血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)时,PI3K、Eph A2蛋白的表达,探讨VM发生的可能机制。方法体外三维培养OCM-1细胞,于三维培养7 d进行过碘酸-雪夫反应(periodic acid schiff reaction,PAS)染色,观察PAS阳性的环状结构的形成(即其形成VM的能力),于1 d、4 d、7 d进行PI3 K和Eph A2免疫组织化学染色并观察其结果。结果OCM-1细胞三维培养4 d,细胞大部分呈多角形,胞浆较丰富,核圆形,可见核仁,少部分肿瘤细胞长梭形,可见3~5个长梭形细胞彼此连接围成半环状结构。7 d后,肿瘤细胞几乎均变成长梭形,沿着胶原支架生长,细胞伸出长的突起,彼此之间相互接触围成环状结构。PAS染色可见瘤细胞大多呈弥散排列,肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道,一层细胞外基质(PAS阳性物质)围成环状结构。与培养1 d的细胞相比,培养4 d和7 d的PI3K和Eph A2蛋白表达量均明显增加(均为P<0.05),并随着时间的推移增加(7 d>4 d>1 d,P<0.05)。结论Eph A2和PI3 K可能在三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的VM形成过程中具有重要作用。

热休克蛋白B6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞管腔形成的影响及其机制

背景血管内皮细胞的增生和迁移是血管发生的主要环节。新近的研究发现，热休克蛋白B6（HspB6）可促进多种与血管新生相关因子的分泌，导致病理状态下新生血管的发生，研究HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力的影响对于脉络膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义。目的探讨HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞管腔形成能力的影响及其机制。方法对人脉络膜血管内皮细胞株进行培养和传代，取对数生长期细胞用于实验。应用逆转录PCR（RT—PCR）和流式细胞术检测HspB6mRNA及其蛋白在人脉络膜血管内皮细胞中的表达。将基质胶铺于96孔板中，凝固后加入细胞悬液，细胞密度为2×10^4个／孔，将不同质量浓度（100μg／L、500μg／L）HspB6中和性抗体分别加入培养孔，未加入HspB6中和性抗体的细胞作为对照组（0μg／LHspB6中和性抗体组），每组设3个复孔。细胞孵育12h后，采用体外三维成型法检测各组完整管腔形成的数量，以评价HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞的管腔形成能力。96孔板培养人脉络膜血管内皮细胞，培养液中加入不同质量浓度（0、50、100、500μg/L）HspB6中和性抗体孵育24h，然后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞的增生值。采用Transwell小室法检测HspB6中和性抗体作用24h后各组穿过小室膜的“贴壁”细胞数目，以评估人脉络膜内皮细胞的增生和迁移情况。收集HspB6中和性抗体干预后的人脉络膜血管内皮细胞，流式细胞术检测HspB6中和性抗体作用后各组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率。结果人脉络膜血管内皮细胞在基因和蛋白水平均可表达HspB6分子。0、100、500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目分别为（67．25±5．75）、（60．39±6．41）和（39．76±10．73）个／视野，总体比较差异有统计学意义（F=10．210，P=0．012），其中500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目明显少于0μg／LHspB6中和性抗体组，差异有统计学意义（P=0．005）。随着HspB6中和性抗体质量浓度的增加和作用时间的延长，其对细胞增生和迁移的抑制率均明显增加，差异均有统计学意义（F质量浓度=7．485，P=0．002；F时间=16．684，P=0．001）。Transwell小室法检测显示，0、50、100、500μg／LHspB6中和性抗体组细胞迁移数目分别为（14．0±2．5）、（11．1±0．8）、（6．6±0．1）、（6．7±0．2）个，其中100μg／L、500μg／LHspB6中和性抗体干预24h后细胞迁移数目较0μg／LHspB6中和性抗体组明显减少，差异均有统计学意义（均P=0．000）。流式细胞术检测结果发现，HspB6中和性抗体组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率为（22．73±2．53）％，对照组为（13．33±2．08）％，差异有统计学意义（t=4．967，P=0．008）。结论HspB6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞的管腔形成有抑制作用，可能通过抑制血管内皮细胞的增生、迁移以及促进细胞的凋亡等途径发挥效应。

虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响

目的:观察虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)血管新生作用的影响,探讨其可能的作用机制。方法:培养RF/6A细胞,分为正常对照组(NC组)、高糖对照组(HG组)、高糖加不同浓度的虫草素组(HG+10μg/m L组、HG+50μg/m L组、HG+100μg/m L组)。采用CCK8法检测各组细胞的增殖活性;采用Transwell实验检测各组细胞的迁移;采用Matrigel检测各组管腔形成的情况;采用Western-blot检测各组细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达的情况。结果:与NC组相比,HG组RF/6A的增殖活性增加(P<0.05)。不同浓度的虫草素对RF/6A的增殖均有抑制作用,随着虫草素浓度增加,细胞活性下降。HG+10μg/m L组、HG+50μg/m L组、HG+100μg/m L组的增殖活性抑制率分别为(10.2±0.9)%、(23.4±1.5)%、(31.1±1.2)%,与HG组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。NC组、HG组、HG+10μg/m L组、HG+50μg/m L组、HG+100μg/m L组细胞迁移个数分别为55.6±2.70、87.4±2.40、65.4±2.7、57.8±2.38、62.4±2.77个。与NC组相比,HG组迁移细胞数量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞迁移数量随着虫草素浓度的增加而减少,与HG组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。NC组、HG组、HG+10μg/m L组、HG+50μg/m L组、HG+100μg/m L组的细胞管腔形成个数分别为18.7±2.08、25.7±1.52、19.9±1.57、16.3±2.51、5.7±1.72个。与NC组相比,HG组细胞管腔形成个数增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞管腔形成个数随着虫草素浓度的增加而减少,与HG组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,HG组VEGF和VEGFR2蛋白表达的量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组中细胞内VEGF和VEGFR2蛋白表达的量均低于高糖对照组(P<0.05)。结论:虫草素可能通过抑制高糖下VEGF和VEGFR2蛋白的表达,抑制RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成,进而抑制血管新生。

牛脉络膜微血管内皮细胞纯化和体外培养的改良方法

目的建立快速、简便地培养脉络膜微血管内皮细胞的方法,为脉络膜新生血管疾病的研究提供细胞模型。方法显微分离牛脉络膜微血管,采用1g·L-1胶原酶一步法消化,并采用免疫磁珠分选脉络膜微血管内皮细胞,使用内皮细胞培养基进行原代培养。利用光学和电子显微镜进行形态学观察,利用Von Willebrand因子免疫荧光染色及Dil-Ac-LDL吞噬实验进行细胞学鉴定,利用管腔形成实验观察内皮细胞形成管腔能力。结果采用本研究改良的方法可以获得纯度高达95%的脉络膜微血管内皮细胞,外观呈细长形,融合后呈典型铺路石样外观。电子显微镜观察可见胞浆内靠近核膜外的Weibel-Palade小体(棒状小体);免疫荧光显示Von Willebrand因子表达阳性,Dil-Ac-LDL吞噬实验阳性;在凝胶中可以形成明显管腔结构。结论本研究改良的方法成功地分离并纯化了牛脉络膜微血管内皮细胞,可在短期内快速简便地获得足够数量的内皮细胞。

血管生成素1对高糖环境中猴脉络膜-视网膜内皮细胞的保护作用

目的探讨高浓度葡萄糖对内皮细胞(endothelial cell,EC)单层通透性模型通透性的影响以及血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)对此的保护作用。方法将猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)接种于孔径0.8μm聚碳酸酯微孔滤膜中,形成致密单层后分三组培养。正常对照组:DMEM高糖培养基,含葡萄糖25mmol/L;;高糖组:DMEM培养基,含葡萄糖40mmol/L;;Ang-高糖组:DMEM培养基,含葡萄糖40mmol/L+Ang-1250ng/ml。于第1天、第3天、第5天、第7天4个时间点建立EC单层通透性模型,检测蛋白质渗透压反射系数(δ)及滤过系数(Kf),以监测EC单层通透性的变化;;利用Westernblot(NBT/BCIP显色法)检测第5天时survivin的表达。结果第3天、第5天及第7天时,高糖组EC单层通透性增高(P<0.01),Ang-高糖组在第5天及第7天时,EC单层通透性升高(P<0.01),但仍低于高糖组;;Westernblot结果显示,Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组(P<0.01)。结论高糖能够增加EC单层通透性,Ang-1能对抗高糖的这种生物学作用。它可能是通过上调凋亡抑制基因survivin的表达,抑制RF/6A的凋亡而发挥生物学作用。

Chemerin对恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞血管形成的影响及其机制研究

目的探究Chemerin对恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞RF/6A血管形成的影响及其可能作用机制。方法RF/6A细胞随机分为3组,其中CO组正常培养RF/6A细胞24 h;CH组RF/6A细胞与10μg·L^(-1) Chemerin混合培养24 h;CN组在CH组基础上+200μmol·L^(-1)N-乙酰半胱氨酸混合培养24 h。通过荧光探针-二氢乙啶(DHE)法、MTT法、细胞划痕实验、基质胶(Matrigel)法、Western blot等检测CO组、CH组、CN组RF/6A细胞活性氧(ROS)表达水平、增殖情况、迁移能力、管腔形成、p38MAPK蛋白表达的差异。结果CH组RF/6A细胞中ROS表达水平、细胞增殖数量均显著高于CO组、CH组(均为P<0.05)。CO组、CH组、CN组RF/6A细胞迁移面积(像素)分别为31268±1397、56489±2653、39684±1864,细胞管腔形成数量分别为(1.06±1.12)个、(6.04±2.24)个、(3.08±3.67)个,3组间细胞迁移面积、管腔形成数量比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,CH组RF/6A细胞中p38MAPK蛋白相对表达量显著高于CO组、CN组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论Chemerin对RF/6A细胞血管形成有促进作用,其机制与ROS介导的MAPK通路激活有关。

加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞增生的抑制作用

背景黄斑区脉络膜新生血管（CNV）是致盲率较高的眼病之一，以往的主要治疗方法是光动力学疗法和玻璃体腔抗血管内皮生长因子（VEGF）药物注射，但均存在一定的不良反应。研究认为，加减驻景方的应用对相关病变有治疗效果。目的探讨加减驻景方含药血清对缺氧状态下大鼠脉络膜血管内皮细胞（RCVECs）增生的影响。方法10只SD大鼠给予0．525g／ml加减驻景方药液20ml／kg灌胃3d，于末次给药后2h无菌条件下采集腹主动脉血，制备加减驻景方含药血清。将培养的RCVECs分为4个组，空白对照组细胞用常规培养液进行培养，氯化钴组在培养液中添加100μmol／L氯化钴100μl以制备细胞缺氧模型，空白血清＋氯化钴组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％空白血清，含药血清＋氯化钻组在缺氧细胞培养液中添加体积分数20％含药血清。细胞培养后24h采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的增生情况；采用逆转录PCR和Western blot技术检测各组细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白的相对表达量。结果培养的RCVECs生长良好，呈梭形。100μmol／L氯化钴作用后成功建立了缺氧细胞模型。MTT法检测显示，空白对照组、氯化钴组、含药血清＋氯化钴组和空白血清＋氯化钴组吸光度（A）值分别为0．659±0．051、0．757±0．553、0．683±0．037和0．731±0．038，其中氯化钴组A值明显高于空白对照组和含药血清＋氯化钴组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。空白对照组、氯化钴组、含药血清＋氯化钴组和空白血清＋氯化钻组细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量总体比较，差异均有统计学意义（HIF-1α mRNA：F=3．100，P〈0．05；VEGF mRNA：F=3．420，P〈0．05；HIF-1α蛋白：F=470．600，P=0．000；VEGF蛋白：F=146．700，P=0．000），其中氯化钴组细胞中HIF-1α mRNA、VEGFmRNA及其蛋白的相对表达量均明显高于空白对照组和含药血清＋氯化钴组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论加减驻景方含药血清可能通过抑制RCVECs分泌HIF-1α和VEGF的机制而抑制缺氧状态下RCVECs的增生。

miR-338-3p/TCF4对脉络膜微血管内皮细胞增生及凋亡的影响

目的探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对脉络膜微血管内皮细胞增生和凋亡的影响及其调控机制。方法体外培养人脉络膜微血管内皮细胞,将培养的细胞分为血管内皮生长因子(VEGF)组和正常对照组,正常对照组细胞常规培养,VEGF组细胞应用VEGF处理24 h;将VEGF组培养的细胞分为4个亚组,分别将阴性对照(miR-NC)、miR-338-3p拟似物、miR-338-3p拟似物+pcDNA、miR-338-3p拟似物+pcDNA-TCF4转染至脉络膜微血管内皮细胞后用VEGF处理24 h。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p和TCF4相对表达量;采用MTT法检测细胞增生率以评估细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;行双荧光素酶报告实验验证miR-338-3p与TCF4的靶向关系;采用Western blot法检测细胞中增生标记蛋白细胞增生核抗原-67(Ki-67)、增生细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(bax)、B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)蛋白相对表达量。结果与正常对照组比较,VEGF组细胞中miR-338-3p mRNA表达水平显著降低,TCF4 mRNA表达水平显著升高,细胞增生率显著升高,细胞凋亡率显著降低,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高,bax蛋白水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与VEGF+miR-NC组比较,VEGF+miR-338-3p组细胞增生率显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著降低,bax蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-338-3p可靶向结合TCF4;与VEGF+miR-338-3p+pcDNA组比较,VEGF+miR-338-3p+pcDNA-TCF4组细胞增生率显著升高[(56.48±13.20)%vs.(96.24±16.24)%],细胞凋亡率显著降低[(30.59±3.57)%vs.(12.36±1.29)%],细胞中Ki-67、PCNA、bcl-2蛋白表达水平显著升高(0.41±0.11 vs.0.96±0.19;0.44±0.10 vs.0.97±0.20;0.55±0.12 vs.0.98±0.15),bax蛋白表达水平显著降低(0.87±0.13 vs.0.42±0.11),差异均有统计学意义(t=5.700、14.408、7.516、7.111、6.715、7.927,均P<0.01)。结论miR-338-3p过表达可负向调控TCF4在细胞中的表达量,从而抑制脉络膜微血管内皮细胞的增生及诱导细胞凋亡。

阈值下微脉冲激光在中心性浆液性脉络膜视网膜病变中的作用机制

中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSC)是发生在中青年患者中常见的黄斑病变,该病具有一定自限性,但治疗不及时也可致病情迁延、反复发作,进展为慢性CSC、继发视网膜色素上皮(RPE)萎缩、脉络膜新生血管等,最终导致中心视力不可逆性损害。阈值下微脉冲激光(SMLP)是一种短促重复的脉冲激光,它不同于具有损伤性治疗作用的传统激光,在达到有效治疗效果的基础上,不会对RPE细胞和光感受器造成损伤和热损伤。在光动力治疗(PDT)缺乏维替泊芬的情况下,因其有效性、安全性和可重复性,SMLP现已广泛应用于临床上CSC的治疗。本综述旨在阐述SMLP治疗CSC过程中涉及的效应细胞、细胞因子及作用机制,以期为SMLP在临床的推广和合理化应用提供更多理论依据。

腺病毒介导的Slit2及Slit2 ShRNA转染缺氧诱导的人RPE细胞对人脉络膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的:观察腺病毒介导的Slit2及Slit2 ShRNA转染缺氧诱导的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells,RPE)细胞对人脉络膜微血管内皮细胞(human choroidal microvascular endothelial cell,HCMEC)增殖的影响,探讨Slit2在脉络膜新生血管中的可能作用,为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)提供新的治疗思路。方法:体外培养并鉴定人RPE细胞、HCMEC;200μmol/L氯化钴建立化学缺氧模型,Transwell小室建立细胞共培养模型;将缺氧的RPE细胞随机分为Slit2组(加入Slit2)、Slit2 ShRNA组(加入Slit2 ShRNA)、空腺病毒组(加入空腺病毒)、缺氧组,12、24、48 h后采用CCK 8(Cell Counting Kit-8,CCK 8)法检测HCMEC的增殖。结果:不同组别存在组间差别,差异均有统计学意义(F=98.122,P=0.000),不同时间点存在差别(F=3388.913,P=0.000),组别与时间点的交互作用(F=82.863,P=0.000)。Slit2组吸光度(absorbance,A)值在24 h、48 h均高于其他组(与缺氧组P=0.001,其余P=0.000),Slit2 ShRNA组A值在24 h、48 h均低于其他组(48 h与缺氧组P=0.003,与空腺病毒组P=0.008,其余P=0.000)。结论:Slit2的高表达可明显促进HCMEC的增殖,沉默RPE细胞中的Slit2的表达后,会明显抑制HCMEC的增殖。

糖基化终产物对脉络膜微血管内皮细胞增生和管腔形成的影响(英文)

目的:研究糖基化终产物(advanced glycationendproducts, AGEs)在年龄相关性黄斑变性发生中的作用。方法:使用lycopersiconesculentum agglutinin包被磁珠的改良方法分离牛脉络膜微血管内皮细胞(bovine choroidalendothelialcells, CEC),采用抗VIII因子免疫细胞化学法和摄取低密度脂蛋白(dil-acetylated low-density lipoprotein,dil-ac-LDL)法进行细胞鉴定。将50g/L牛血清白蛋白和150g/L葡萄糖在37℃孵育6wk 以制备AGEs,通过抗-AGEs 抗体点杂交法定性分析。用MTT 法(3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl te-trazolium bromide assay)测定CEC 增生,用Vit-rogen凝胶系统观察管腔形成情况。结果:培养细胞中90%以上呈因子阳性,并具有摄取dil-ac-LDL的能力,表明具有内皮细胞的特征。制备的AGEs 与抗-AGEs 抗体具有亲和力。浓度在62.5～500mg/L范围内的AGEs 处理CEC 3d 后,细胞增生呈剂量依赖性增加。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)可明显增强CEC 中管腔样结构的形成(P <0.05),但500mg/L和50mg/L的AGEs 对CEC 管腔形成无明显影响(P >0.05)。结论:AGEs 可以促进CEC 的增生,但对其管腔形成无影响。提示AGEs 通过增强CEC 增生,可能是渗出型AMD 发病中潜在的启动因子之一?

乳酸脱氢酶A促进人脉络膜黑色素瘤细胞的生长

目的成功构建带有Flag标签的人乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的真核表达载体,初步检测LDHA基因对人脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)MUM-2B细胞生长功能的影响。方法将军事科学院传代培养的人CM系随机分为实验组和对照组,实验组MUM-2B细胞瞬时转染构建成功带有Flag标签的人LDHA重组质粒(Flag-LDHA),对照组MUM-2B细胞瞬时转染Flag空载质粒;以带有GST标签的Flag-LDHA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增LDHA基因,并将其插入到Flag载体,应用菌液PCR、双酶切和测序方法鉴定重组质粒,鉴定成功后瞬时转染人CM,通过Western blot鉴定其表达;CCK8法检测并绘制生长曲线。结果PCR技术扩增得到长约1000 bp的LDHA基因的编码区序列,并成功克隆至Flag载体上;与对照组相比,实验组菌液PCR结果为阳性,双酶切鉴定结果为切开两条长约4000 bp的Flag载体和1000 bp的LDHA基因条带,测序鉴定结果为插入的序列与LDHA基因的编码序列完全一致。Western blot检测结果显示,与对照组相比,实验组MUM-2B细胞成功表达LDHA蛋白;CCK8法检测结果显示,实验组MUM-2B细胞较对照组MUM-2B细胞生长快。结论成功构建了Flag-LDHA真核表达载体,并发现LDHA基因能够促进人CM MUM-2B细胞的生长,为研究LDHA在人CM的发生发展中的功能奠定基础。

Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对MART-1基因启动子活性的影响

目的探讨黑色素抗原转录子Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对T细胞可识别抗原-1(melanoma antigen recognized by T cells 1,MART-1)启动子活性的影响。方法采用RT-PCR和Western blot检测人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285和Ocm3细胞中Brn-2的mRNA和蛋白表达水平。将含不同长度MART-1基因启动子序列和荧光素酶报告基因的表达质粒p GL3-Luc构建成融合表达载体p GL3-p286-Luc及p GL3-p2956-Luc,与p EV-Brn-2融合表达质粒共转染脉络膜黑色素瘤细胞系细胞。分别测量四种细胞系中p286组、p2956组、p286+Brn-2组、p2956+Brn-2组细胞荧光素酶表达变化,并观察Brn-2对上述细胞MART-1基因启动子活性的影响。结果人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285、Ocm3细胞系均可检测到Brn-2 mRNA和蛋白的表达,Brn-2蛋白电泳带大致在相对分子质量47 000处。p GL3-p2956-Luc及p GL3-p286-Luc重组质粒经Apa I和Nhe I双酶切可切出2956 bp和286 bp 2个条带,p EV-Brn-2重组质粒经EcoRI和Bam HI双酶切可切出1329 bp条带。p EV-Brn-2重组质粒分别对人脉络膜黑色素瘤细胞系Ocm3、Mel285、92-2、92-1进行磷酸钙法转染,Western blot检测可见四种细胞系均表达Brn-2蛋白。缺乏Brn-2时,所有细胞的MART-1的p286均显示出活性,MART-1阳性细胞系(92-1、92-2、Ocm3)p286活性高于阴性细胞系(Mel285)。p2956活性不同细胞系表现不同,92-1、92-2中较高,Ocm3中其活性与细胞密度相关,MART-1阴性细胞系中p2956近乎无活性。共转染Brn-2后明显下调92-1、92-2、Ocm3中启动子p286及p2956活性(P<0.05);阴性细胞系Mel285中,Brn-2对启动子活性无影响(P>0.05)。结论 Brn-2表达于人脉络膜黑色素瘤细胞,并下调阳性细胞系MART-1启动子活性。

内皮抑素对缺氧条件下脉络膜视网膜内皮细胞增殖、迁移及管腔形成的作用

目的内皮抑素是一种重要的血管生成抑制剂,本研究旨在研究内皮抑素对缺氧条件下培养的猴脉络膜、视网膜内皮细胞(RF/6A)增殖、迁移和管腔形成的作用。方法取生长状况良好的RF/6A细胞用于用于实验,将细胞随机分为缺氧组、缺氧+不同浓度重组人内皮抑素组、对照组。培养24 h后采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶法检测管腔形成。结果缺氧24 h,细胞增殖活力、迁移和管腔形成均明显增加,使用0.5~10μg/ml重组人内皮抑素预处理可明显抑制缺氧诱导的细胞增殖、迁移和管腔形成(P<0.05)。内皮抑素的上述抑制作用均随其浓度的升高而增强。结论内皮抑素能够明显抑制缺氧诱导的RF/6A细胞的增殖、迁移和管腔形成,提示内皮抑素对脉络膜和视网膜新生血管具有一定的抑制作用。

木犀草素对脉络膜恶性黑色素瘤细胞的影响

为探讨木犀草素调节Wnt/β-catenin信号通路对人脉络膜恶性黑色素瘤细胞(MuM-2C)凋亡、迁移和侵袭的影响,采用CCK 8法测定0,5,10,15,20,25μmol/L浓度木犀草素处理24 h后的MuM-2C活力,以筛选合适的药物作用浓度.将体外培养的MuM-2C随机分为3组:对照组、木犀草素组及木犀草素+氯化锂组,木犀草素组以15μmol/L木犀草素处理,木犀草素+氯化锂组以15μmol/L木犀草素和10μmol/L的氯化锂联合处理.采用流式细胞技术和Hoechst 33258染色检测MuM-2C的凋亡情况,采用划痕实验和Transwell实验检测各组MuM-2C的迁移、侵袭情况,采用免疫荧光检测各组MuM-2C中凋亡蛋白BAX与BCL-2表达,采用免疫印记检测各组MuM-2C中EMT标志蛋白(E-cadherin,N-cadherin,Vimentin)和Wnt/β-catenin信号相关蛋白(Wnt1,β-catenin)表达,结果表明:不同剂量木犀草素均可抑制MuM-2C生长,并在一定范围内随剂量升高而作用增强;与对照组比较,木犀草素组细胞核形态固缩而大小不一,着色不均匀,部分呈现明亮的蓝色荧光,表现为明显的凋亡病理现象,细胞凋亡率、细胞BAX/BCL-2比值与E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞迁移率与侵袭数、细胞蛋白(N-cadherin,Vimentin,Wnt1,β-catenin)表达显著降低(P<0.05);与木犀草素组比较,木犀草素+氯化锂组细胞核的凋亡病理现象明显减轻,细胞凋亡率、细胞BAX/BCL-2比值与E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞迁移率与侵袭数、细胞蛋白(N-cadherin,Vimentin,Wnt1,β-catenin)表达显著升高(P<0.05).说明木犀草素可通过抑制Wnt/β-catenin信号途径传导而降低MuM-2C活力,促进其凋亡,并抑制其迁移和侵袭.

HDAC抑制剂SAHA对脉络膜黑色素瘤细胞OCM1的作用

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)细胞系OCM1增殖侵袭的机制。方法使用显微镜观察不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)对OCM1细胞形态结构的影响,利用CCK-8实验观察不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)对OCM1细胞活力的影响,通过EdU染色法和克隆形成实验观察control组(0μmol/L SAHA)和1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖的变化,通过划痕实验和迁移侵袭实验观察control组和1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞迁移侵袭能力的变化。采用Western blot实验检测不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)组中HDAC4、CyclinD1、c-Myc、E-cadherin和Snail蛋白表达水平。结果与control组相比较,光镜下明显可见0.625μmol/L SAHA组、1.25μmol/L SAHA组、2.5μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖能力减弱,促进细胞皱缩和死亡,且细胞增殖活力降低(P<0.05)。与control组比较,1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖和迁移侵袭能力明显降低(P<0.05)。此外,与control组相比较,0.625μmol/L SAHA组、1.25μmol/L SAHA组、2.5μmol/L SAHA组E-cadherin蛋白表达逐渐升高,而HDAC4和Snail蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。结论SAHA可通过抑制HDAC4明显降低OCM1细胞增殖活力和迁移侵袭能力。

舒肝明目汤含药血清调节HIF1α-VEGF-Notch1通路活性影响脉络膜血管新生作用的研究

[目的]探讨舒肝明目汤含药血清对大鼠脉络膜血管内皮细胞(CECs)增殖的影响及与HIF1α-VEGF-Notch1通路相关的调节机制。[方法]CECs细胞在常氧和低氧条件下进行培养,检测低氧条件下舒肝明目汤含药血清对CECs增殖移行能力的影响;并采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)技术检测细胞中低氧诱导因子1α(HIF1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和Notch1 m RNA和蛋白表达的水平。[结果]与正常组相比,低氧组CECs的增殖移行能力明显提高(P<0.01),CECs中HIF1α、VEGF和Notch1 m RNA及蛋白表达明显增多(P<0.01)。经含药血清处理后,CECs增殖移行能力较低氧组显著下降(P<0.01),同时HIF1α和VEGF m RNA及蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05),而Notch1表达进一步增高(P<0.01)。[结论]舒肝明目汤含药血清通过上调Notch1表达及下调HIF1α-VEGF通路活性抑制CECs增殖迁移,从而减少脉络膜新生血管生成。