吲哚美辛抑制人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1裸鼠移植瘤生长的研究

背景吲哚美辛能有效抑制多种肿瘤细胞的增生，但其对脉络膜黑色素瘤（CM）是否具有抑制作用尚不清楚。目的探讨吲哚美辛对人CM细胞系OCM-1细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法将OCM-1细胞植入24只雌性裸鼠腋周皮下建立移植瘤模型，建模后5～6d，待肿瘤长至5mm大小时，将荷瘤鼠随机分为空白对照组、生理盐水组、吲哚美辛1mg／kg组、吲哚美辛2mg／kg组，按组每日腹腔注射相应的药物，连续用药2周，观察肿瘤生长情况。2周后处死动物，称量肿瘤重量并计算抑瘤率；应用免疫组织化学法检测各组动物肿瘤组织中ki67、survivin蛋白的表达；逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法分析各组小鼠肿瘤组织中survivinmRNA的表达。结果吲哚美辛1mg／kg组、吲哚美辛2mg／kg组较空白对照组、生理盐水组CM肿瘤体积缩小、重量减轻，与空白对照组、生理盐水组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；吲哚美辛2mg／kg组CM肿瘤的体积和重量均小于吲哚美辛1mg／kg组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。吲哚美辛1mg／kg组、吲哚美辛2mg／kg组的抑瘤率分别为22．86％、48．00％，抑瘤率随吲哚美辛剂量的增加而升高。免疫组织化学染色及RT—PCR检测表明，吲哚美辛2mg／kg组ki67增生指数、survivin蛋白及mRNA在肿瘤组织中的表达较空白对照组、生理盐水组明显下降，差异均有统计学意义（P〈0．05）；但吲哚美辛1mg／kg组与其他3组问上述3项指标的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论吲哚美辛可通过下调survivin的表达抑制OCM-1细胞的增生，从而抑制OCM-1裸鼠移植瘤的生K。

Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对MART-1基因启动子活性的影响

目的探讨黑色素抗原转录子Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对T细胞可识别抗原-1(melanoma antigen recognized by T cells 1,MART-1)启动子活性的影响。方法采用RT-PCR和Western blot检测人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285和Ocm3细胞中Brn-2的mRNA和蛋白表达水平。将含不同长度MART-1基因启动子序列和荧光素酶报告基因的表达质粒p GL3-Luc构建成融合表达载体p GL3-p286-Luc及p GL3-p2956-Luc,与p EV-Brn-2融合表达质粒共转染脉络膜黑色素瘤细胞系细胞。分别测量四种细胞系中p286组、p2956组、p286+Brn-2组、p2956+Brn-2组细胞荧光素酶表达变化,并观察Brn-2对上述细胞MART-1基因启动子活性的影响。结果人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285、Ocm3细胞系均可检测到Brn-2 mRNA和蛋白的表达,Brn-2蛋白电泳带大致在相对分子质量47 000处。p GL3-p2956-Luc及p GL3-p286-Luc重组质粒经Apa I和Nhe I双酶切可切出2956 bp和286 bp 2个条带,p EV-Brn-2重组质粒经EcoRI和Bam HI双酶切可切出1329 bp条带。p EV-Brn-2重组质粒分别对人脉络膜黑色素瘤细胞系Ocm3、Mel285、92-2、92-1进行磷酸钙法转染,Western blot检测可见四种细胞系均表达Brn-2蛋白。缺乏Brn-2时,所有细胞的MART-1的p286均显示出活性,MART-1阳性细胞系(92-1、92-2、Ocm3)p286活性高于阴性细胞系(Mel285)。p2956活性不同细胞系表现不同,92-1、92-2中较高,Ocm3中其活性与细胞密度相关,MART-1阴性细胞系中p2956近乎无活性。共转染Brn-2后明显下调92-1、92-2、Ocm3中启动子p286及p2956活性(P<0.05);阴性细胞系Mel285中,Brn-2对启动子活性无影响(P>0.05)。结论 Brn-2表达于人脉络膜黑色素瘤细胞,并下调阳性细胞系MART-1启动子活性。

抑制PTBP1对脉络膜黑色素瘤细胞增殖和侵袭力的影响

目的探讨多聚嘧啶区结合蛋白1(PTBP1)对脉络膜黑色素瘤(CM)细胞增殖活性和迁移、侵袭能力的影响。方法选取人CM细胞系OCM-1,根据转染序列的不同分为si-PTBP1组(转染PTBP1特异性干扰序列)、si-Control组(转染阴性对照序列)和空白组(不作任何处理)。分别检测各组细胞PTBP1 mRNA的表达,以及PTBP1、上皮型钙黏蛋白(E-Cad)和波形蛋白的表达。通过细胞实验分析各组细胞的增殖活性和迁移、侵袭能力。结果si-PTBP1组PTBP1 mRNA相对表达量显著低于si-Control组和空白组(P<0.05),si-Control组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72和96h,si-PTBP1组细胞增殖活性均低于si-Control组和空白组(P<0.05)。si-PTBP1组迁移细胞数和侵袭细胞数均少于si-Control组和空白组(P<0.05)。si-PTBP1组PTBP1和波形蛋白相对表达量低于si-Control组和空白组(P<0.05),E-Cad相对表达量高于si-Control组和空白组(P<0.05)。结论抑制OCM-1细胞PTBP1表达可抑制细胞增殖活性,削弱细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制上皮-间质转化有关。

miR-375表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨miR-375表达对脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞增殖和侵袭的影响。方法:培养MUM-2B细胞,分别转染miR-375模拟物序列(模拟物组)、miR-375抑制物序列(抑制物组)、阴性对照序列(阴性对照组)和不做任何处理(空白组),分别采用qRT-PCR实验、CCK-8实验、细胞凋亡实验、Transwell实验检测细胞中miR-375、细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞迁移和侵袭情况。结果:相比于阴性对照组(1.01±0.10)和空白组(1.03±0.07),模拟物组细胞中miR-375表达量(2.65±0.15)升高,而抑制物组细胞中miR-375表达量(0.28±0.06)降低(P<0.05);与空白组和阴性对照组比较,模拟物组细胞24、48、72和96h时OD值均降低(P<0.05),而抑制物组细胞24、48、72和96h时OD值均升高(P<0.05);与空白组细胞凋亡率(20.54±4.01)%和阴性对照组细胞凋亡率(22.80±4.28)%比较,模拟物组细胞凋亡率(39.11±3.37)%升高(P<0.05),而抑制物组细胞凋亡率(10.13±2.17)%降低(P<0.05);与空白组和阴性对照组比较,模拟物组细胞迁移数和细胞侵袭数均降低(P<0.05),而抑制物组细胞迁移数和细胞侵袭数均升高(P<0.05)。结论:上调MUM-2B细胞中miR-375表达可降低细胞增殖活性,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,下调miR-375表达则发挥相反的作用,表明miR-375可能在脉胳膜黑色素瘤病程中发挥抑癌功能。

木犀草素对脉络膜恶性黑色素瘤细胞的影响

为探讨木犀草素调节Wnt/β-catenin信号通路对人脉络膜恶性黑色素瘤细胞(MuM-2C)凋亡、迁移和侵袭的影响,采用CCK 8法测定0,5,10,15,20,25μmol/L浓度木犀草素处理24 h后的MuM-2C活力,以筛选合适的药物作用浓度.将体外培养的MuM-2C随机分为3组:对照组、木犀草素组及木犀草素+氯化锂组,木犀草素组以15μmol/L木犀草素处理,木犀草素+氯化锂组以15μmol/L木犀草素和10μmol/L的氯化锂联合处理.采用流式细胞技术和Hoechst 33258染色检测MuM-2C的凋亡情况,采用划痕实验和Transwell实验检测各组MuM-2C的迁移、侵袭情况,采用免疫荧光检测各组MuM-2C中凋亡蛋白BAX与BCL-2表达,采用免疫印记检测各组MuM-2C中EMT标志蛋白(E-cadherin,N-cadherin,Vimentin)和Wnt/β-catenin信号相关蛋白(Wnt1,β-catenin)表达,结果表明:不同剂量木犀草素均可抑制MuM-2C生长,并在一定范围内随剂量升高而作用增强;与对照组比较,木犀草素组细胞核形态固缩而大小不一,着色不均匀,部分呈现明亮的蓝色荧光,表现为明显的凋亡病理现象,细胞凋亡率、细胞BAX/BCL-2比值与E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞迁移率与侵袭数、细胞蛋白(N-cadherin,Vimentin,Wnt1,β-catenin)表达显著降低(P<0.05);与木犀草素组比较,木犀草素+氯化锂组细胞核的凋亡病理现象明显减轻,细胞凋亡率、细胞BAX/BCL-2比值与E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞迁移率与侵袭数、细胞蛋白(N-cadherin,Vimentin,Wnt1,β-catenin)表达显著升高(P<0.05).说明木犀草素可通过抑制Wnt/β-catenin信号途径传导而降低MuM-2C活力,促进其凋亡,并抑制其迁移和侵袭.

贝伐单抗对人眼脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞血管生成拟态的影响

目的:通过体内外实验探讨贝伐单抗对人眼脉络膜黑色素瘤细胞(MUM-2B)血管生成拟态的影响及可能相关的分子通路。方法:通过不同浓度的贝伐单抗(0,0.1,1,2,3 mg/mL)处理MUM-2B细胞,观察其对MUM-2B细胞成管能力的影响。通过CCK-8法及Transwell法检测其对MUM-2B细胞增殖及侵袭的影响。然后,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过不同剂量的贝伐单抗(5 mg/kg,7.5 mg/kg,10 mg/kg)干预,探究贝伐单抗对裸鼠皮下移植瘤VM形成的影响,并通过CD31/PAS免疫组化双重染色法检测VM的表达情况,免疫组化法检测HIF-1a、VE-cadherin、EphA2、PI3K蛋白表达水平变化。结果:体外实验中,不同浓度的贝伐单抗(0,0.1,1,2,3 mg/mL)处理MUM-2B细胞24小时后,对MUM-2B细胞的成管能力、增殖、侵袭能力并没有表现出明显的抑制或促进作用。实验组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在体内实验中,贝伐单抗实验组(5 mg/kg,7.5 mg/kg,10 mg/kg)与对照组相比较能显著的促进MUM-2B细胞形成VM的能力(P<0.05),且形成管道的数量与贝伐单抗的浓度呈正相关(r=0.942,P<0.05)。实验组HIF-1a、VE-cadherin、EphA2和PI3K-Akt蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05),且各分子的表达量随着贝伐单抗浓度的升高呈浓度依赖性的升高。结论:体外实验中,贝伐单抗对MUM-2B细胞的成管能力,增殖,侵袭能力并没有表现出明显的抑制或促进作用。体内实验中,贝伐单抗的使用能促进HIF-1a的表达、上调VE-cadherin/EphA2/PI3K-Akt后续的级连信号通路,从而加速VM的生成。

HDAC抑制剂SAHA对脉络膜黑色素瘤细胞OCM1的作用

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)细胞系OCM1增殖侵袭的机制。方法使用显微镜观察不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)对OCM1细胞形态结构的影响,利用CCK-8实验观察不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)对OCM1细胞活力的影响,通过EdU染色法和克隆形成实验观察control组(0μmol/L SAHA)和1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖的变化,通过划痕实验和迁移侵袭实验观察control组和1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞迁移侵袭能力的变化。采用Western blot实验检测不同浓度SAHA(0.625,1.25,2.5μmol/L)组中HDAC4、CyclinD1、c-Myc、E-cadherin和Snail蛋白表达水平。结果与control组相比较,光镜下明显可见0.625μmol/L SAHA组、1.25μmol/L SAHA组、2.5μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖能力减弱,促进细胞皱缩和死亡,且细胞增殖活力降低(P<0.05)。与control组比较,1.25μmol/L SAHA组OCM1细胞增殖和迁移侵袭能力明显降低(P<0.05)。此外,与control组相比较,0.625μmol/L SAHA组、1.25μmol/L SAHA组、2.5μmol/L SAHA组E-cadherin蛋白表达逐渐升高,而HDAC4和Snail蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。结论SAHA可通过抑制HDAC4明显降低OCM1细胞增殖活力和迁移侵袭能力。

基于倾向性评分逆概率加权法的脉络膜黑色素瘤患者疗效评价研究

目的 在平衡组间基线变量后,评价放射治疗与手术联合放射治疗两种治疗方式对脉络膜黑色素瘤患者的疗效,分析脉络膜黑色素瘤患者的预后影响因素,为脉络膜黑色素瘤的有效诊疗提供参考依据。方法 对2000年1月至2019年12月在SEER数据库中登记的脉络膜黑色素瘤患者进行分析,采用倾向性评分逆概率加权法(IPTW)对放射治疗和手术联合放射治疗两组患者的基线特征进行平衡。结果 本研究共筛选脉络膜黑色素瘤患者5547例,其中接受放射治疗者4422例、接受手术联合放射治疗治疗者1125例。在接受放射治疗的4422例患者中,光束辐射(BR)组1155例,放射性植入物(RI)组2608例,放射性同位素(RIT)组659例。Log-rank检验结果显示,逆概率加权前后,放射治疗组患者的预后均高于手术联合放射治疗组(P<0.000 1)。多因素Cox回归分析结果显示,在控制了种族、性别、多灶性、是否为首要恶性肿瘤、婚姻状态、从诊断到治疗的时间、年龄、眼别、诊断确认、放射治疗方法等混杂因素后,与放射治疗组患者相比,手术放射治疗组患者的特异性死亡风险为HR=4.385(95%CI=3.542~5.428)。与年龄<50岁组患者相比,50~<60岁组、60~<70岁组、70~<80岁组、≥80岁组患者的特异性死亡风险分别为HR=3.083(95%CI=0.825~4.238)、HR=4.045(95%CI=2.955~5.532)、HR=4.512(95%CI=3.115~6.529)、HR=6.877(95%CI=4.151~11.398);与恶性肿瘤数为1个组患者相比,肿瘤数为2个组和>2个组患者的特异性死亡风险分别为HR=0.698(95%CI=0.449~2.944)、HR=0.538(95%CI=0.317~0.913);从诊断到治疗的时间超过1个月的患者的风险比为2.732~4.154。Log-rank检验结果表明,IPTW前后BR、RI和RIT三组脉络膜黑色素瘤患者生存曲线间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 放射治疗的长期疗效优于手术与放射治疗联合治疗;年龄、单病灶、诊断到治疗的时间和治疗方式可增加脉络膜黑色素瘤患者死亡的风险,是影响脉络膜黑色素瘤患者预后的独立影响因素。

基于SEER数据库数据的脉络膜黑色素瘤预后预测模型构建

目的构建脉络膜黑色素瘤预后预测模型。方法收集美国国家癌症研究所SEER数据库中2010—2015年2235例诊断为脉络膜黑色素瘤患者的临床资料数据(年龄、性别、婚姻状况、种族、TNM分期、病理学类型、骨转移、肺转移、肝转移、手术信息、放化疗情况、生存时间、生存状态等信息),将所有患者以7∶3的比例,随机分为建模组1584例及验证组651例。首先将建模组中的临床资料数据利用R4.1.2软件中“survival”包的Cox风险比例回归模型进行单因素及多因素分析,得出影响脉络膜黑色素瘤患者预后的独立影响因素。基于筛选出的影响因素使用R4.1.2软件中“rms”包构建脉络膜黑色素瘤预后预测模型。在建模组和验证组中通过C指数、ROC以及校准曲线评价该预测模型的区分度和一致性。结果年龄、病理学类型、T分期、M分期、局部放疗为影响脉络膜黑色素瘤预后的独立影响因素,基于以上因素,构建脉络膜黑色素瘤预后预测模型。在建模组和验证组中预后预测模型C指数分别为0.732(95%CI:0.710,0.761)和0.713(95%CI:0.670,0.756)。建模组中预后预测模型预测1年、2年、3年预后的ROC下面积分别为0.780、0.766、0.777;在验证组中预后预测模型预测1、2、3年预后的ROC下面积分别为0.890、0.755、0.734,两组数据均高于0.7,说明具有良好的区分度。建模组和验证组的校准曲线均与平面直角坐标系中45°的直线重合度较高,说明具有良好的一致性。结论脉络膜黑色素瘤预后预测模型建立成功,其对患者预后具有良好的预测效能。

一例脉络膜恶性黑色素瘤患者的围手术期护理

脉络膜恶性黑色素瘤是成年人最常见的眼内恶性肿瘤,恶性程度高,预后差,本文主要总结一例2022年6月收住于我院的一名脉络膜恶性黑色素瘤患者行眼球摘除术围手术期的护理经验,包括术前检查指导,心理评估与干预,术后饮食护理,病情观察,疼痛管理等,经过精心护理患者术后恢复良好,手术效果满意,顺利出院,并给予出院后日常护理指导,患者术后一月复查时恢复效果好,外观美观,无并发症,患者满意。本例病案中发现对于恶性肿瘤患者的心理评估与干预不仅局限于患者本身,还包括患者家属,护士及时的沟通与鼓励是患者与家属信心建立的基础,专业的护理指导与心里安慰是克服恐惧的关键,所以总结本案例护理经验,针对不同的患者需求提供专业的护理服务,减轻患者顾虑,提高患者住院满意度。

姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株血管形成拟态抑制作用及其相关机制的研究

目的研究姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1血管形成拟态(vasculogenic mimicry,VM)及其PI3K信号通路的影响。方法三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,观察其形成VM的能力。观察梯度浓度(0μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1))的姜黄素对OCM-1细胞株VM形成的影响,采用免疫细胞化学检测参与VM形成的PI3K与EPHA2的表达。结果姜黄素在体外可以抑制OCM-1细胞株VM的形成,呈浓度依赖性。姜黄素对OCM-1细胞Eph A2和PI3K蛋白表达的影响:Eph A2和PI3K蛋白表达随姜黄素(10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1))浓度的升高呈浓度依赖性降低。各组分别与0μmol·L^(-1)姜黄素组比较,差异均有统计学意义(均为P=0.000),其中30μmol·L^(-1)姜黄素组和40μmol·L^(-1)姜黄素组比较,差异无统计学意义(P=0.300、P=0.188)。结论姜黄素能明显抑制OCM-1细胞株VM的形成,其机制可能与下调EPHA2、PI3K蛋白的表达,从而抑制PI3K信号通路有关。

Aumolertinib可体内外抑制人脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞的增殖

目的评估新型第3代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂Aumolertinib对人脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞增殖的影响,探索Aumolertinib在眼科肿瘤治疗中的应用潜力。方法不同浓度Aumolertinib(0、2、4、6、8、10μmol/L)处理MUM-2B细胞。用CCK-8法检测Aumolertinib对MUM-2B细胞存活率的影响;细胞集落克隆形成实验检测Aumolertinib对MUM-2B细胞的增殖抑制作用;利用流式细胞分析技术检测Aumolertinib对MUM-2B细胞凋亡坏死、线粒体膜电位、活性氧、细胞周期分布的影响;建立人脉络膜黑色素瘤细胞MUM-2B裸鼠荷瘤模型,设置空白组,给药组(40 mg/kg),考察Aumolertinib在体内的抗肿瘤活性。结果CCK-8和细胞集落克隆形成实验的结果表明,Aumolertinib显著抑制MUM-2B细胞的增殖,并呈浓度依赖性。凋亡坏死分析结果显示,当Aumolertinib浓度增加到8μmol/L时,MUM-2B细胞的总凋亡率可达到76.65%。同时,MUM-2B细胞内ROS水平也随Aumolertinib浓度增加显著增多。此外,Aumolertinib能够有效降低MUM-2B细胞的线粒体膜电位,诱导MUM-2B细胞发生G1期周期停滞。体内研究表明,Aumolertinib有效抑制肿瘤增长,而不会使动物体质量明显减轻。结论Aumolertinib对人脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞在体外、体内试验中均发挥有效的抗肿瘤作用,在脉络膜黑色素瘤的治疗方面具有潜在用途。

microRNA-449抑制脉络膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移

目的探讨脉络膜黑色素瘤细胞M21转染microRNA-449后对增殖和迁移的影响,及其分子机制的初探。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的方法,将microRNA-449转染入体外培养的人脉络膜黑色素瘤细胞。应用MTS法检测转染后细胞增殖的影响;Transwell小室检测细胞迁移的变化;Western blotting检测c-Met蛋白的表达。结果转染microRNA-449后,脉络膜黑色素瘤细胞增殖明显被抑制(P<0.01),迁移亦受抑制(P<0.01),c-Met表达量下降。结论转染microRNA-449对体外培养的人脉络膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移具有抑制作用,microRNA-449可下调c-Met蛋白的表达水平。

单克隆抗体连结光敏物质对脉络膜黑色素瘤细胞的光免疫治疗作用

应用单克隆抗体 IG12连结光敏物质 CMA,形成免疫连结物 Mc Ab-CMA,估价其对体外人眼黑色素瘤培养细胞 OCM43 1的光免疫治疗作用 ,另设 RPMI1846黑色素瘤细胞作为对照组。氩离子 -染料激光波长65 4nm,连结 1mm光导纤维 ,光斑直径 3 5 mm。靶细胞和对照细胞的存活率用 MTT法测得。结果 :靶细胞(OCM43 1)预先与免疫连结物培养 ,激光照射剂量 5～ 40 J/cm2 显示靶细胞存活率随着激光剂量增加而明显降低。在相同激光照射剂量下 ,增加免疫连结物的浓度 ,细胞存活曲线亦随着降低 ,当免疫连结物的量增加超过6μM时 ,肿瘤的光毒作用趋平缓。对照细胞 (RPMI1846)给予相同的照射条件 ,在激光剂量 40 J/cm2 时仍有 74±2 .6%细胞存活。认为单克隆抗体

姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1血管生成拟态形态学和病理改变的影响

目的研究不同浓度姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株(OCM-1)血管生成拟态形态学和病理学改变的影响。方法三维培养OCM-1细胞株,观察梯度浓度为0μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1)的姜黄素对OCM-1细胞株血管生成拟态形成的影响,分别进行形态学观察和病理学PAS染色。结果形态学观察显示:姜黄素0μmol·L^(-1)组:OCM-1细胞有浸润,在鼠尾胶上叠加生长,随着时间的延长,部分细胞逐渐伸展、变形,呈长条状、梭状或弧状;培养1周后细胞与细胞之间相互连接,并可呈管状、腔样、树枝样、网状等管腔结构,即血管生成拟态;姜黄素10μmol·L^(-1)组:部分OCM-1细胞能够形成条梭状和长条形,血管生成拟态形成;姜黄素20μmol·L^(-1)组:部分OCM-1细胞能呈长条形和梭形,但不能形成血管生成拟态;姜黄素30μmol·L^(-1)组:大部分细胞呈圆形,少数细胞能形成长条形和梭形,但不能形成血管生成拟态;姜黄素40μmol·L^(-1)组细胞皱缩成圆形,不能形成血管生成拟态。病理学PAS染色显示:姜黄素0μmol·L^(-1)组:大部分肿瘤细胞表达PAS阳性物质,相互连接形成环状、管腔样结构,即血管生成拟态;姜黄素10μmol·L^(-1)组:部分OCM-1细胞呈条梭状和长条形,PAS染色阳性,形成网格状血管生成拟态结构;姜黄素20μmol·L^(-1)组:部分OCM-1细胞呈长条形和梭形,PAS染色阳性,少部分呈网格状结构;姜黄素30μmol·L^(-1):大部分细胞呈圆形,PAS染色阴性,少数细胞能形成长条形和梭形,PAS染色阳性,但不形成网格状结构;姜黄素40μmol·L^(-1)组:细胞皱缩成圆形,PAS染色阴性,不形成网格状结构。结论姜黄素在体外可以抑制OCM-1细胞株血管生成拟态的形成,存在形态学和病理学改变,呈浓度依赖性。姜黄素浓度达到30μmol·L^(-1)时,对OCM-1细胞株血管生成拟态的形成具有明显的抑制作用。

T细胞识别的黑色素瘤抗原1在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达

目的观察T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及启动子甲基化对其表达的可能影响。方法人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285和Ocm3常规培养。采用免疫荧光染色流式细胞仪及Western blot检测各细胞系MART-1蛋白的表达;RT-PCR检测各细胞系中MART- 1 mRNA转录水平;甲基敏感的限制性核酸内切酶消化结合Southern blot分析MART-1启动子DNA的甲基化状态。结果免疫荧光染色流式细胞仪及Western blot检测结果显示,MART-1蛋白在92-1、92-2和Ocm3细胞系表达阳性,Me1285细胞系表达阴性。与蛋白检测结果一致,RT-PCR检测可见MART-1 mRNA在92-1、92-2、Ocm3细胞系中转录,Me1285未观察到转录。MART-1阳性细胞系92-1、92-2、Ocm3和阴性细胞系Mel285存在不同的甲基化模式。阳性细胞系在MspⅠ/HpaⅡ位点甲基化,内含子NruⅠ位点未甲基化;而阴性细胞系在MspⅠ/HpaⅡ位点未甲基化,NruⅠ位点过甲基化。结论MART-1可在人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2和Ocm3中表达。MART-1启动子甲基化模式的改变可能影响MART-1的转录。

人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的三维培养及血管生成拟态机制的研究

目的通过体外三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,观察其生成血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)时,PI3K、Eph A2蛋白的表达,探讨VM发生的可能机制。方法体外三维培养OCM-1细胞,于三维培养7 d进行过碘酸-雪夫反应(periodic acid schiff reaction,PAS)染色,观察PAS阳性的环状结构的形成(即其形成VM的能力),于1 d、4 d、7 d进行PI3 K和Eph A2免疫组织化学染色并观察其结果。结果OCM-1细胞三维培养4 d,细胞大部分呈多角形,胞浆较丰富,核圆形,可见核仁,少部分肿瘤细胞长梭形,可见3~5个长梭形细胞彼此连接围成半环状结构。7 d后,肿瘤细胞几乎均变成长梭形,沿着胶原支架生长,细胞伸出长的突起,彼此之间相互接触围成环状结构。PAS染色可见瘤细胞大多呈弥散排列,肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道,一层细胞外基质(PAS阳性物质)围成环状结构。与培养1 d的细胞相比,培养4 d和7 d的PI3K和Eph A2蛋白表达量均明显增加(均为P<0.05),并随着时间的推移增加(7 d>4 d>1 d,P<0.05)。结论Eph A2和PI3 K可能在三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的VM形成过程中具有重要作用。

深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞的机制

【目的】研究-70℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制。【方法】OCM-1细胞反复冻融后,用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力,免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化,电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变,并测定细胞的凋亡比率,流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化。【结果】噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示,冻融可以直接杀伤OCM-1细胞,且残存的细胞生长能力也明显受抑制。免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性,而冻融后的细胞均呈阴性,冻融后培养的细胞部分呈阳性。电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化。激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多。流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降,冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显,且呈一定的量效关系。【结论】冻融不仅可以明显杀伤OCM-1瘤细胞,还能抑制残存瘤细胞生长。反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡,此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因,其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关。冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强,可能是增强机体的免疫应答,介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。

IFN-α 2b对人脉络膜黑色素瘤细胞的毒性作用及对端粒酶活性的影响

目的:研究干扰素(IFN-α2b)对人眼脉络膜黑色素瘤细胞端粒酶活性的影响及其对细胞的毒性作用,为临床化疗提供更多依据。方法:采用原代培养的人眼脉络膜黑色素瘤细胞做实验材料,用不同浓度IFN-α2b、作用不同时间,设立对照组,用MTT法检测IFN-α2b对细胞的毒性作用,PCR-ELISA法测定细胞中端粒酶活性的变化,并对两者关系进行相关分析。结果:随着IFN-α2b浓度及作用时间的增加,细胞中端粒酶活性逐渐下降,在药物浓度大于5×104IU/L及作用时间达到24 h后,其活性出现大幅度下降,随后出现细胞抑制率的明显升高,与端粒酶活性的下降具有一定的相关性。但均发生不同程度的滞后现象。结论:IFN-α2b可作为一种端粒酶抑制剂,有效降低体外培养的人眼脉络膜黑色素瘤细胞的端粒酶活性,呈浓度和时间依赖性,并造成细胞死亡。