以壳聚糖和明胶为复合生物墨水3D打印的脊髓仿生支架及其生物相容性研究

目的:探究3D打印脊髓仿生支架的复合生物墨水配方及生物相容性和可靠性评估。方法:利用3D打印技术,以壳聚糖(chitosan,C)和明胶(gelatin,G)为基础复合生物墨水,比较不同配比复合生物墨水的理化性能:孔隙率、溶胀率、流变性能、降解速率、力学性能分析。通过优化打印参数,打印出特定空间构型的脊髓外形仿生支架。接着运用仿生支架材料浸提液与SH-SY5Y细胞共培养方法,通过扫描电子显微镜和CCK-8实验评估该支架材料的细胞毒性及其对细胞增殖能力的影响。结果:通过比较最终选择4%浓度的C和6%浓度G(4C6G)组为最适的复合生物墨水配方并进行后续的研究。在打印速度1.5 mm/s、压强0.09~0.11 MPa、层厚0.1 mm、间距1 mm、针头0.11 mm的参数下,可以实现打印出5 mm×5 mm×0.9 mm尺寸的蝴蝶形状高保真度的脊髓仿生支架。扫描电子显微镜可见SH-SY5Y细胞黏附在支架内部,并且能正常生长;CCK-8结果显示,浸提液无细胞毒性。结论:以C和G为复合生物墨水有望成为脊髓损伤修复仿生支架的原材料。

3-D打印胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架的研究

目的利用3-D生物打印机制备胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,为组织工程化治疗脊髓损伤提供细胞载体。方法制备硫酸肝素-胶原蛋白水凝胶,采用3-D打印仿生脊髓支架,扫描电镜观察其结构,排水法计算孔隙率,体外降解实验测量支架p H值和质量变化。取孕14 d SD大鼠的胎鼠脑皮质分离培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs),实验分为2组,A组取仿生脊髓支架体外与NSCs共培养,B组直接将细胞悬液接种于预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上。采用光镜和扫描电镜观察细胞黏附与形态变化,MTT检测细胞活力,免疫荧光染色鉴定NSCs的分化情况。结果 3-D打印机成功制备出胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,扫描电镜显示内部具有纵行排列、平行的微孔结构,孔隙率为90.25%±2.15%;体外降解实验中,支架p H值未发生明显变化,8周左右支架降解完全,符合组织工程支架要求。MTT检测示两组培养1、3、7 d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P>0.05);光镜观察两组均可见大量神经球分化,神经纤维交织成网状;培养7 d A组扫描电镜观察示细胞黏附于支架上,大量细胞伸出轴突,并且有神经球形成;免疫荧光染色示,两组均可分化为神经元和胶质细胞,定量分析显示A、B组分化率分别为29.60%±2.68%和10.90%±2.13%,差异有统计学意义(t=17.30,P=0.01)。结论 3-D打印的胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性,能促进NSCs增殖和分化,作为神经组织工程支架具有良好的研究和应用前景。

人脂肪干细胞复合猪小肠黏膜下层脱细胞基质/壳聚糖温敏凝胶体内构建组织工程脂肪的研究

目的探讨人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,h ADSCs)与猪小肠黏膜下层脱细胞基质微粉(small intestinal submucosa powder,SISP)/壳聚糖温敏水凝胶复合构建组织工程脂肪的可行性。方法取乳癌患者自愿捐赠脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离h ADSCs。取第3代细胞与SISP/壳聚糖温敏水凝胶混匀,制成浓度为1×106个/m L的液态凝胶。将24只5周龄健康雌性裸鼠随机分为实验组及对照组(n=12),于颈背部皮下分别注射1 m L h ADSCs+SISP/壳聚糖温敏水凝胶或SISP/壳聚糖温敏水凝胶。注射后0、1、2、4、8周测量植入物体积,评价其降解情况;注射后1、2、4、8周两组各处死3只裸鼠,大体观察后取材行组织学及免疫组织化学染色观察,评价植入物成分构成变化(HE染色)、成脂能力(油红O染色)、血管形成情况(CD31标记)及材料内h ADSC存活分化(人波形蛋白标记)。结果注射后随时间延长,两组植入物均逐渐缩小;但各时间点实验组植入物体积均大于对照组,且8周时差异有统计学意义(t=3.348,P=0.029)。大体观察示各时间点两组植入物均边界清楚、无粘连,至8周时均可见黄色新生组织,且表面有毛细血管包裹。组织学观察示,注射后植入物结构逐渐变紧密,SISP逐渐降解,且实验组降解速度较对照组慢,脂肪逐渐形成,至8周时实验组中央出现少量成熟脂肪组织;各时间点实验组油红O染色阳性面积均大于对照组,且8周时差异有统计学意义(t=3.411,P=0.027)。免疫组织化学染色示,各时间点实验组均有h ADSCs存活;植入物有新生血管生成,2周时达峰值,各时间点两组CD31阳性面积比较差异无统计学意义(P>0.05),但实验组植入物中血管化更均匀。结论 SISP/壳聚糖温敏水凝胶可作为载体,复合h ADSCs植入裸鼠体内后可构建组织工程脂肪。