脊髓损伤修复相关10号基因编码蛋白与促甲状腺激素释放激素受体2的相互作用

背景:前期研究中,通过酵母双杂交系统筛选出可能与脊髓损伤修复相关10号基因(No10,SCIRR10)编码蛋白相互作用的蛋白质,其中含有促甲状腺激素释放激素受体2(thyrotropin releasing hormone receptor2,TRH R2),而SCIRR10与TRH R2是否存在相互作用尚未阐明。目的:验证SCIRR10蛋白是否作用TRH R2受体,进一步确认TRH R2为SCIRR10蛋白受体,为下一步研究提供可靠实验证据。方法:应用RT-PCR方法扩增SCIRR10和TRH R2基因,构建带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标签的真核重组表达质粒GFP-SCIRR10和RFP-TRH R2,分别转染真核细胞COS7,培养16h后,将表达SCIRR10-GFP的细胞培养液加入到表达受体TRH R2-RFP细胞中继续培养。4h后,用40g/L多聚甲醛固定细胞,于激光共聚焦显微镜下观察蛋白GFP-SCIRR10和蛋白RFP-TRH R2两者相互结合情况。结果与结论:在荧光条件下仅能观察到SCIRR10-GFP与TRH R2-RFP相互结合,而其他对照没有观察到类似现象。通过实验以及前期研究结果证实TRHR R2就是SCIRR10作用受体。

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。

周围神经损伤晚期修复后脊髓后角P物质和降钙素基因相关肽变化的定量研究

目的探讨周围神经损伤晚期修复后脊髓后角内P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)变化,以反映脊髓后角的功能状态。方法新西兰兔16只腓总神经切断1年后修复,术后1,3,5月取腰骶段脊髓,切片作SP、CGRP免疫组化染色。采用计算机图像分析对后角内SP、CGRP含量进行定量分析研究。结果失神经1年后,脊髓后角内SP、CGRP含量分别为正常的70%和86%。腓总神经晚期修复后,后角内SP、CGRP先丧失,随后逐步恢复,至术后5月,后角内SP、CGRP含量接近正常。结论周围神经损伤晚期修复后,脊髓后角有再生表现,从神经肽角度证明晚期神经损伤有修复价值。

PTEN基因在周围神经损伤修复中的作用机制研究进展

周围神经损伤是影响人类健康的重大疾病之一,由于该病损伤修复机制阐述不明,使其治疗效果不佳,也因此成为临床领域骨科医生的治疗难点。近年来,第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)在周围神经损伤修复中研究较多,本文就PTEN基因通过调控周围神经损伤后的突触再生、炎性及免疫反应、神经元凋亡、神经营养相关因子等过程以及核因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)、非受体酪氨酸激酶/信号传导及转录激活蛋白(Jak/stat)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路的作用影响周围神经损伤后的修复进程作一综述,为相关研究提供便利。

神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用研究进展

脊髓损伤的修复是世界性难题,近年来神经干细胞的发现及其相关研究,为脊髓损伤的修复开辟了一条新途径。该文综述了近年来神经干细胞、带有外源基因的神经干细胞、诱导内源性神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用研究进展。

SCIRR 10截短体真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建SCIRR 10蛋白3个截短体的哺乳动物细胞表达系统,探讨SCIRR 10蛋白的功能位点。方法:PCR扩增出SCIRR 10蛋白的3个功能截短体表达DNA序列,构建3种真核表达质粒载体pcDNA3.1/Myc-His-SCIRR 10(1-145aa)、pcDNA3.1/Myc-His-SCIRR 10(1-90aa)和pcDNA3.1/Myc-His-SCIRR 10(1-70aa)。将3个表达载体质粒转染到COS-7细胞中,应用Western blotting方法检测3个蛋白截短体的表达情况。结果:3个被截短的SCIRR 10蛋白相对分子质量分别为18 800、12 800和10 700。在COS-7细胞中可以成功表达3个SCIRR 10蛋白截短体。相对3个SCIRR 10截短体蛋白的表达量,β-tubulin蛋白无明显变化。结论:成功构建SCIRR 10蛋白3个截短体的哺乳动物细胞表达系统,通过此系统获得有生物活性的3个SCIRR10截短体蛋白。

第10号染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路在大鼠脊髓发育过程中的表达

目的 观察第10号染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因（PTEN）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在大鼠脊髓发育过程中的表达模式.方法 选取不同发育阶段（孕15 d子鼠记为A组,出生当天大鼠记为B组,出生后7d大鼠记为C组,出生后56 d大鼠记为D组）的SD大鼠,取出其脊髓,采用Western blot法检测该通路上关键蛋白的表达水平;同时,采用免疫荧光法检测各相应蛋白在大鼠脊髓的细胞定位.结果 Western blot结果显示,A、B、C、D组PTEN与内参肌动蛋白（actin）的灰度值比分别为0.281±0.086、0.462 ±0.002、0.591±0.022、0.392±0.001,A组与其他3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,D组与B、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;A、B、C、D组S6与actin的灰度值比分别为0.646 ±0.116、0.450±0.129、0.824±0.082、0.174±0.038,D组与A、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）.免疫荧光染色结果显示脊髓神经元有丰富的PTEN与S6表达.结论 这些结果提示PTEN/mTOR信号通路可能与发育相关的表达模式,从而为中枢神经系统再生能力随着发育过程而降低这一现象提供依据.

DJ-1在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是心肌梗死后冠状动脉再通治疗的常见并发症,严重影响急性心肌梗死患者心功能恢复,导致患者预后不良,同时也增加了患者主要不良心血管事件的发生率和病死率。帕金森病相关蛋白7(PARK7/DJ-1)作为一种多功能蛋白,参与氧化应激、细胞自噬与凋亡调控、线粒体稳态维持、信号转导等与MIRI密切相关的病理生理过程。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路及核转录因子红系2相关因子2信号通路均在MIRI中发挥重要作用,而DJ-1作为上述通路的重要启动元件,可直接参与MIRI的发生、发展。MIRI病理机制复杂,进一步研究DJ-1在MIRI中的作用,可能为有效防治MIRI提供新的靶点和潜在研究方向。

微小RNA-494对促进脊髓损伤后功能恢复和抑制细胞凋亡的研究

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-494在脊髓损伤中的作用及其意义。方法应用脊髓表面挫伤的方法建立大鼠脊髓损伤模型。分为1个假损伤对照组和5个脊髓损伤组,每组5只大鼠(购自复旦大学实验动物中心)。用miRNA芯片分析脊髓损伤后不同时间miRNA的表达。用agomiR-494鞘内治疗后,评定大鼠运动功能。正态性采用Shapiro-Wilk正态检验,组间差异采用单因素方差分析和双侧t检验。结果与假损伤对照组比较,有14个miRNA上调,有46个miRNA下调2倍,而miR-494是最显著下调的miRNA之一。与单纯SCI组比较,agomiR-494鞘内治疗后的SCI+agomiR-494组,大鼠运动功能明显改善,剩余组织(甲酚紫染色评估)增多,TUNEL阳性细胞减少。agomiR-494对miR-494的上调可促进脊髓损伤后大鼠的功能恢复,减小病变大小并抑制凋亡细胞。脊髓组织中miR-494的表达与第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)的表达呈负相关(r=-0.834,P<0.05)。此外,miR-494通过直接靶向BV-2细胞中的3’端非编码区(3’UTR)来抑制蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负调节剂PTEN。结论在大鼠脊髓损伤模型中miR-494的过表达通过抑制PTEN的表达来激活Akt/mTOR信号通路,对脊髓损伤具有保护作用。

nup88、Ataxin-3和PTEN在结直肠癌中表达关系的研究

目的检测核孔蛋白复合体蛋白88（nup88）、脊髓小脑共济失调症相关蛋白3（Ataxin-3）和第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源等位基因（PTEN）在结直肠癌中的表达特点,探讨三者的表达关系。方法选择2011年1∽12月平山县人民医院外2科103例结直肠癌术后患者作为观察组,选择68例正常结肠黏膜作为对照组,采用免疫组织化学检测两组nup88、Ataxin-3和PTEN的表达,分析其相关性。结果观察组中nup88表达的阳性率显著高于对照组[71.8%（74/103）比20.6%（14/68）],观察组中Ataxin-3和PTEN表达的阳性率显著低于对照组[35.0%（36/103）比82.4%（56/68）,19.4%（20/103）比73.5%（50/68）],差异有统计学意义（P〈0.05）。观察组中nup88、Ataxin-3和PTEN的表达在不同Dukes分期、有无淋巴结转移、是否有癌结节及脉管浸润间阳性率差异有统计学意义（P〈0.05）;线性相关分析显示,观察组中nup88、Ataxin-3与PTEN的表达无相关性（P〉0.05）。结论结直肠癌中nup88、Ataxin-3和PTEN异常表达,但是三者不具有协同作用,3种蛋白可能是通过各自的通路发挥促肿瘤进展的作用。