美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达

背景:脊髓损伤有氧化应激、炎症、凋亡、自噬等机制参与其中,激活自噬可改善脊髓损伤后的神经运动功能,对脊髓起保护作用。目的:探讨美洲大蠊研粉对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能和损伤区域自噬蛋白Beclin-1的影响。方法:取30只6-8周龄SD大鼠,采用随机数字表法分为3组,每组10只:假手术组仅打开椎板,暴露脊髓后缝合;生理盐水组与美洲大蠊组均建立左侧脊髓半横断损伤模型,术后第1天开始分别灌胃给予生理盐水与美洲大蠊研粉,连续给药14 d。术后6 h及1,3,7,14 d行BBB评分,观察后肢运动功能的情况;给药14 d后处死大鼠,采用免疫组化染色、Western Blot检测、免疫荧光染色检测脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达情况。结果与结论:①随着术后时间的延长,生理盐水组、美洲大蠊组大鼠BBB评分逐渐升高;与假手术组比较,生理盐水组、美洲大蠊组术后6 h及1,3,7,14 d的BBB评分均降低(P<0.05);美洲大蠊组术后7,14 d的BBB评分高于生理盐水组(P<0.05);②免疫组化染色显示,假手术组Beclin-1呈弱阳性表达,主要位于胞浆;生理盐水组Beclin-1主要位于胞浆,可见部分核膜表达;美洲大蠊组Beclin-1主要位于胞浆,可见部分核膜表达;生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于假手术组(P<0.05),美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于生理盐水组(P<0.05);③Western Blot检测与免疫荧光染色显示,生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于假手术组(P<0.05),美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于生理盐水组(P<0.05);④结果表明,美洲大蠊研粉能够改善脊髓半横断损伤大鼠的后肢运动功能,机制可能是美洲大蠊研粉中的多糖类物质增加了自噬蛋白Beclin-1的表达。

移植神经干细胞促进脊髓全横断大鼠结构与功能修复的研究

目的 探讨移植神经干细胞对脊髓全横断性大鼠部分结构与功能修复的影响。 方法 在脊髓全横断处移植神经干细胞 6 0d后 ,在横断处下方 3mm注射荧光金逆行标记轴突再生的上运动神经元 ,用免疫组织化学检测神经干细胞在宿主内的分化 ,同时用体视学方法观测脑干红核和大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层的神经元密度变化。用BBB评分法和爬网格法观测大鼠后肢运动功能的恢复等。 结果 移植的神经干细胞能在宿主内存活并向前后方向迁移到脊髓内 ,部分神经干细胞分化为GFAP、NF 2 0 0和GAP 4 3阳性细胞。移植神经干细胞后在红核和感觉运动区内锥体细胞层可见有被荧光金标记的神经元胞体 ,脊髓横断处附近脊髓组织的溃变程度减轻 ,红核及躯体感觉运动区内神经元密度高于未移植组 ,大鼠后肢的自主运动功能明显好于未移植组。 结论 神经干细胞移植入损伤脊髓后能分化为神经元及神经胶质细胞 ,能减轻脊髓的继发性损伤 ,保护受损伤的神经元 。

大鼠脊髓切断术后神经纤维残留量与运动功能恢复的关系

目的 观察成年大鼠下胸段脊髓切断术后是否出现神经纤维残留 ,以及神经纤维残留量与后肢运动功能恢复的关系。 方法 取 12只成年大鼠 ,以尖刀片沿椎管骨壁横切下胸段脊髓。术后定期观察截瘫后肢运动功能恢复情况 ,8周处死动物 ,灌注后取损伤部位及其上下节段脊髓 ,矢状冰冻切片 ,抗神经丝抗体免疫组织化学染色 ,光镜下观察有无残留神经纤维 ,计算机技术重建脊髓横断面 ,确定残留纤维的部位及其所占脊髓横断面的比例 ,并分析残留纤维数量与后肢运动功能恢复程度的相关性。 结果 42 %动物出现程度不等的后肢运动功能恢复 ,其脊髓横切处腹侧或腹外侧有数量不等的神经丝免疫反应残留纤维 ,并与后肢运动功能的恢复呈正相关关系。 结论 以尖刀片横切大鼠脊髓的常用方法 ,易造成脊髓神经纤维的残留 ,少量残留纤维即可引起后肢运动功能相当程度的恢复。因此 ,在评价脊髓损伤后的功能恢复时 ,必须首先确定损伤是否完全。

督脉电针治疗大鼠全横断性脊髓损伤的实验研究

目的 :探讨督脉电针对大鼠全横断性脊髓损伤的行为和结构修复的影响。方法 :用BBB评分法和爬网格试验检测全横断性脊髓损伤及督脉电针治疗后大鼠的运动功能 ,荧光金逆行标记法检测再生神经元 ,用生长相关蛋白 43 (GAP 43 )免疫组织化学法观察脊髓损伤区周围神经元GAP 43的表达。结果 :督脉电针治疗后大鼠后肢运动功能有明显地恢复 ,损伤区脊髓组织退变减轻 ,躯体感觉运动区内锥体细胞层及红核内的神经元密度增大 ,脊髓组织内GAP 43阳性神经元增多 ,在脊髓横断头侧端灰质内、躯体运动感觉区及红核内有少量被标记细胞。结论 :督脉电针治疗可减轻脊髓损伤后的继发性损伤 。

稳定性大鼠脊髓全横断模型的建立

目的:建立SD大鼠稳定、易复制的脊髓完全横断动物模型,并摸索术后护理方法,探讨性别对动物模型的影响。方法:实验于2005-03/09在南方医科大学临床解剖学研究所和广东省组织构建与检测重点实验室完成。①取40只SD大鼠(雌雄各半),体制量220～250g,按性别分为两组。体积分数为0.15的水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg)大鼠,于T10节段处,用锐利刀片于硬膜外快速切割、完全横断脊髓,切除2mm脊髓节段,医用明胶海绵填充脊髓断端间隙。②术后,大鼠单笼饲养,皮下注射青霉素20万单位,1次/d、5mL生理盐水2次/d,持续1周;每日定时膀胱挤压排尿两三次,给与截瘫护理。③定期观察大鼠后肢运动情况,并进行BBB评分(0￣21分,得分越高后肢运动功能越好),动物存活8周以上。结果:①动物模型脊髓损伤程度完全一致,术后1周内所有大鼠BBB评分皆为0分。②术后8周内大鼠因膀胱破裂死亡5只(雌2雄3),雌、雄大鼠死亡率比较无差异(P>0.05)。③所有大鼠均可观察到不同程度的后肢自发性功能恢复,以第3,4周最为明显,至第8周BBB评分雌性为7.41±2.55,雄性为7.06±3.05。各时间点雌雄比较无差异(P>0.05)。结论:①建立的脊髓完全横断大鼠模型效果稳定,可复制性强,制作简便,护理方法有效。②大鼠在术后死亡率和术后后肢功能自发性恢复方面无性别上的差异。

胶原或明胶吸附施万细胞移植促进全横断脊髓损伤修复的研究

目的 探讨胶原或明胶吸附施万细胞移植对全横断脊髓结构和功能修复的影响。 方法 将胶原或明胶吸附施万细胞移植到成年大鼠全横断脊髓的损伤处 ,术后 3个月用爬网格方式测试动物后肢自主运动功能恢复情况 ;用荧光金逆行标记法观察大脑感觉运动区和脑干红核的神经元神经纤维再生 ;用免疫组织化学法检测脊髓CGRP和 5 HT能神经纤维再生。 结果 移植施万细胞的大鼠后肢自主运动功能有显著的恢复。大脑感觉运动区和脑干红核均有被荧光金标记的神经元胞体 ,提示两个区域的神经元轴突能在脊髓再生并穿越损伤区到达尾侧脊髓。脊髓损伤处有CGRP和 5 HT阳性神经纤维 ,以及损伤处尾侧有 5 HT阳性神经纤维。对照组大鼠以上结果均为阴性。 结论 施万细胞移植可促进大鼠全横断脊髓结构和功能的恢复。胶原或明胶可作为移植细胞的网架用于细胞治疗。

超早期高压氧治疗对脊髓全横断大鼠脊髓水肿及后肢运动功能的影响

目的探讨超早期高压氧治疗对脊髓全横断损伤大鼠脊髓水肿及后肢运动功能的影响。方法(1)55只3月龄健康雌性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,15只)、模型组(CSCT组,20只)及高压氧组(HBO组,20只)。Sham组仅行椎板切除术,其余2组均行T10椎板水平脊髓完全横向切断术。(2)HBO组于术后第3小时置于动物舱内开始高压氧治疗,10天1疗程,共3疗程,其中第1疗程每天2次,第2、3疗程均每天1次,每疗程休息6d。(3)分别于建模型后第1～6周末,采用BBB运动功能评分法评价并比较两组大鼠后肢运动功能恢复程度;术后6周末取材,观察各组受损脊髓节段组织含水量变化。结果CSCT组及HBO组大鼠术后第1-6周末BBB运动功能评分逐渐增高,HBO组在2～6周末的BBB运动功能评分均明显高于CSCT组(P<0.05);术后6周末,CSCT组受损脊髓节段组织含水量较Sham组明显增加(P<0.01),HBO组受损脊髓节段组织含水量较CSCT组有所减少(P<0.05)。结论超早期高压氧治疗可减轻脊髓全横断损伤大鼠脊髓组织水肿,促进后肢运动功能的部分恢复,对脊髓有保护作用。

大鼠脊髓全横断后脑源性神经营养因子及其高亲和力受体在运动皮质表达的变化

目的 研究大鼠脊髓全横断后脑源性神经营养因子 (BDNF)及其高亲和力受体 (TrkB)在运动皮质表达的变化 ,为进一步探索脊髓损伤后再生修复机制和神经营养因子治疗脊髓损伤提供实验依据。 方法 雄性SD大鼠 4 2只随机分为 3组 :1 脊髓横断组 :动物脊髓在胸 9节段完全横断 ,按存活时间不同分为术后 3、7、14、2 1及 2 8d组 ;2 假手术组 (只行椎板切除术 ) ;3 正常对照组。动物到达存活时间点后 ,应用免疫组织化学ABC方法和图像分析技术检测TrkB及BDNF在运动皮质的表达和分布。 结果 对照组和实验组运动皮质TrkB和BDNF阳性细胞主要分布在第 5层 ,第 3、4、6层也有少量阳性细胞。脊髓全横断后TrkB和BDNF的表达逐渐增高 ,于术后 2 1d达高峰 ,2 8d回到正常水平 ,且TrkB表达上调早于BDNF。 结论 脊髓全横断后运动皮质对BDNF的需求增加 ,内源性BDNF的增加可能有利于受损的皮质脊髓束神经元的存活与再生 ;在损伤早期给予外源性BDNF可能更有利于受损的皮质脊髓束神经元。

补阳还五汤对红核脊髓束横断后神经元的保护作用

目的:探讨补阳还五汤(BYHWD)对红核脊髓束横断后神经元保护作用的影响。方法:雌性SD大鼠随机分为3组:1.正常组;2.实验组:C3-4右侧红核脊髓束横断后灌服补阳还五汤;3.对照组:C3-4右侧红核脊髓束横断后灌服蒸馏水;用FG逆行示踪定位红核脊髓束神经元在红核的分布。动物存活8周后,Nissl染色计数红核脊髓束神经元并计算其平均截面积。结果:红核神经元的数目和平均截面积实验组分别减少了22%和35%,对照组分别减少了42%和64%。结论:BYHWT不仅提高了轴突横断后红核神经元的存活率,还对其萎缩有抑制作用。

大鼠脊髓全横断损伤模型的建立

目前用于脊髓全横断的动物模型,常遗有部分未损脊髓组织,局部脊髓损伤范围很大,尤其是破坏了的血运扩大了继发性变性,造成了复杂的局部病理变化,致使难以分析治疗性脊髓伤区内移植的疗效。因此迫切需要一种还原论式的脊髓横断模型,本实验设计了一种切割辅以吸除的方法,可以在局部造成平均约0.6mm的清洁横断区,同时保存脊髓腹、背动脉及脊髓背静脉的大鼠脊髓横断模型,并用H.E.染色法、神经丝(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法及生物素化的葡萄糖胺(BDA)的追踪方法检验损伤区及其两侧脊髓的组织反应。

艾灸对脊髓横断术后大鼠胃黏膜组织相关因子及热休克蛋白70表达的影响

目的观察艾灸对大鼠胃黏膜组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)及热休克蛋白70(HSP70)表达的影响,探讨艾灸对胃黏膜的保护效应与脊髓的关系。方法实验大鼠采用无水乙醇+阿司匹林灌胃制作胃黏膜损伤模型。将48只SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组,每组12只。艾灸+脊髓横断组大鼠行脊髓横断手术,并予以艾灸干预。GUTH法计算胃黏膜组织损伤指数(UI),ELISA检测血清IL-1β、TNF-α和EGF含量;Western blot检测胃黏膜组织HSP70蛋白表达。结果与模型组比较,艾灸模型组大鼠胃黏膜组织UI下降、EGF含量升高,血清IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.01);与艾灸模型组比较,艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织UI升高、EGF含量降低,血清IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织HSP70蛋白表达均明显增加(P<0.01)。结论脊髓是艾灸对胃黏膜损伤修复与保护因子表达的重要调节途径。

神经干细胞与NT-3基因修饰雪旺细胞联合移植促进全横断脊髓损伤大鼠功能修复的实验研究

目的:探讨神经干细胞(NSCs)与神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)联合移植对全横断脊髓损伤大鼠的后肢运动及神经传导功能修复的作用。方法:将NSCs与NT-3基因修饰SCs或未基因修饰SCs联合移植,或NSCs单独移植到大鼠全横断性脊髓损伤处,60d后进行爬网格测验和BBB评分检测运动功能。第67d,进行皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质感觉诱发电位(CSEP)检测脊髓的神经传导功能。结果:脊髓损伤大鼠后肢的运动功能及CMEP和CSEP的修复程度依次为NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植组,NSCs与未基因修饰SCs联合移植组,NSCs单独移植组和实验对照组。结论:NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植能够促进脊髓损伤后大鼠的后肢运动及神经传导功能的修复。

大鼠脊髓横断模型的建立及米诺环素对胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:观察米诺环素干预对脊髓横断大鼠行为功能和横断部位胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组,假手术组、模型组和米诺环素预处理组.米诺环素预处理组大鼠术前腹腔注射米诺环素(90 mg/kg).各组大鼠于术后1、7、14、21d应用Molt斜板试验和BBB评分方法对大鼠后肢行为功能进行评价.第22天将所有实验大鼠处死后取损伤段脊髓,H-E染色观察其病理变化、免疫组织化学检测GFAP的表达.结果:术后第1天模型组和米诺环素预处理组大鼠Molt斜板障碍率无明显差别,BBB运动功能评分也无明显差别;而米诺环素预处理组术后第7天到第21天Molt斜板障碍率较模型组有明显下降,且BBB运动功能评分明显高于模型组.H-E染色显示,模型组大鼠有明显的病理变化,而米诺环素预处理组可改善损伤脊髓的病理形态.免疫组织化学显色显示,与模型组相比,米诺环素预处理组GFAP阳性细胞数减少,差异具有统计学意义.结论:米诺环素预处理可有效抑制脊髓横断大鼠神经胶质细胞的过度增殖,有利于神经功能的恢复.

大鼠脊髓全横断后TrkA和TrkB在前角运动神经元的表达

为了探讨脊髓全横断损伤后神经营养因子受体表达的变化 ,本研究取大鼠 C6 和 L5节段脊髓进行 Trk A和 Trk B的免疫组织化学反应。用 HPIAS-10 0 0高清晰度彩色图像细胞测量系统检测免疫阳性神经元的数量和平均灰度。结果显示 ,大鼠脊髓全横断后 ,两种受体 Trk A和 Trk B在运动神经元的表达均出现短暂上调 ,其中 Trk A在颈段的表达高峰出现在损伤后 14 d而腰段为损伤后 7d;与此不同 ,Trk B在颈段和腰段两个部位的表达高峰均出现在 3d。在高峰之后 ,两种受体的表达均下降 ,至术后2 8d已接近或低于正常水平。提示 ,大鼠脊髓全横断损伤后 ,神经营养因子特异性受体 Trk A和 Trk B的表达有一定的时空规律 ,即损伤后 Trk B的表达由短暂上调到表达下降 ,随之出现 Trk A的表达高峰 ,意味着 Trk B的表达下降可能促进 Trk

经颅和经脊髓重复磁刺激对脊髓半横断大鼠运动功能的作用

目的观察经颅和经脊髓重复磁刺激对脊髓半横断大鼠运动功能的影响。方法建立T10大鼠脊髓半横断模型,脊髓半横断大鼠于术后4 d分别给予经颅和经脊髓重复磁刺激治疗,刺激强度为最大输出强度的35%,刺激频率5 Hz,每序列5 s,间歇2 min,连续10个序列,每天1次,每周5 d,连续2周。各组大鼠治疗前和治疗后进行BBB评分和水平梯子实验评价运动功能;术后38 d取患侧下肢胫前肌行降钙素基因相关肽免疫组织化学染色。结果经颅磁刺激组大鼠手术17 d后各时间点BBB评分和水平梯子实验步态正确率高于术后3 d和脊髓损伤组(P<0.05);经脊髓磁刺激组大鼠手术10 d后各时间点BBB评分和步态正确率高于术后3 d和脊髓损伤组(P<0.05),术后10 d步态正确率高于经颅磁刺激组(P<0.05)。经颅和经脊髓磁刺激组大鼠胫前肌运动终板降钙素基因相关肽表达显著高于脊髓损伤组(P<0.001)。结论早期经颅和经脊髓磁刺激可促进脊髓半横断大鼠运动功能改善,并改变远端肌肉的可塑性,经脊髓磁刺激可加速脊髓半横断大鼠运动功能恢复。

超早期高压氧治疗对脊髓全横断损伤大鼠股骨骨钙、骨生物力学及骨胶原的影响

目的探讨超早期高压氧治疗对脊髓全横断损伤大鼠股骨骨钙、骨生物力学及骨胶原的影响。方法 75只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=15)、模型组(n=20)和高压氧组(n=40),其中高压氧组又分为3小时组(高压氧1组,n=20)和12小时组(高压氧2组,n=20)。假手术组仅行椎板切除术,其他三组均行T10水平脊髓完全横向切断术。高压氧1组和高压氧2组分别于术后第3、12小时开始高压氧治疗,10 d为1个疗程,共3个疗程。治疗后,各组取右股骨测定股骨生物力学性能参数,测定骨钙、骨羟脯氨酸(Hyp)含量;HE染色和Masson染色观察骨小梁和骨胶原形态学变化。结果治疗后,与假手术组比较,模型组股骨结构力学和材料力学参数下降(P<0.05),骨干重、骨钙及Hyp含量减少(P<0.05);骨小梁及骨胶原数目减少,稀疏、断裂、排列不整。与模型组和高压氧2组比较,高压氧1组股骨结构力学和材料力学参数均增高,骨干重、骨钙及Hyp含量增加(P<0.05),骨小梁及骨胶原数目增多,连续性较好,排列较整齐。结论超早期高压氧治疗可明显改善脊髓全横断损伤大鼠股骨骨钙含量,改善骨胶原含量及质量,改善生物力学性能。

大鼠脊髓全横断后脊髓内BDNF表达的变化

为了探讨大鼠脊髓全横断后不同时相(3、7、14、21d)脊髓内BDNF表达的变化,我们采用免疫组织化学ABC法和阳性神经元计数,来检测脊髓全横断后不同时相BDNF的表达。结果发现:(1)BDNF免疫阳性产物主要位于腹角运动神经元,胞浆着色;(2)脊髓全横断后脊髓腹角BDNF阳性细胞数3d开始增多,7d达高峰(P<0.05),14d恢复正常(P>0.05)。提示BDNF表达的变化可能与脊髓可塑性有关。

超早期高压氧应用对脊髓完全横断损伤大鼠后肢骨密度的影响

目的:探讨超早期高压氧应用对脊髓完全横断损伤大鼠后肢骨密度(BMD)的影响。方法:①55只3月龄健康雌性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,15只)、模型组(CSCT组,20只)及高压氧组(HBO组,20只)。Sham组仅行T10椎板切除术,其余两组均行T10椎板水平脊髓完全横向切断术。②HBO组于术后第3小时置于动物舱内开始高压氧处理,10d为1疗程,共3疗程,其中第一疗程每日2次,第二、三疗程均每日1次,每疗程间休息6d。③术后6周末取材,采用DelphiA型扇形束DEXA骨密度仪检测各组离体股骨、胫骨整体及其不同区域BMD。结果:CSCT组与Sham组比较,前者股骨整体、股骨远端(FR1,FR2)、近端(FR6,FR7)及胫骨近端(TR1,TR2)BMD均明显下降,差异有显著性意义(P<0.05—0.01);HBO组与CSCT组比较,前者股骨整体BMD明显增加(P<0.05),而胫骨整体、股骨及胫骨其他各区域BMD均略呈上升趋势,但差异无显著性意义。结论:超早期高压氧应用可减缓脊髓完全横断损伤大鼠后肢骨丢失。

促神经再生因子复合剂N6对大鼠脊髓横断损伤保护作用的量效关系

目的:观察促神经再生因子复合剂N6对大鼠脊髓横断损伤后丙二醛(MDA)及caspase-3表达的影响,探讨其减轻继发性损伤及凋亡,保护受损脊髓作用的量效关系。方法:Wistar大鼠84只,随机分为4组。横断脊髓T10段15min后,对照组在脊髓缺损处给予生理盐水83μl/kg、实验组分别给予N6复合剂41.5,83,166μl/kg。损伤后1,4,24h各取材6只,采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定脊髓断端及血清中脂质过氧化(LPO)产物丙二醛(MDA)的含量。损伤后72h每组3只灌注取材,行免疫组化观察断端caspase-3的表达情况,HE染色观察断端病理学改变。结果:各实验组伤后1,4,24h脊髓断端及血清MDA含量明显低于对照组(P<0.01),伤后72h脊髓灰质前角caspase-3阳性细胞数与对照组比较明显减少(P<0.05),且N6复合剂能减轻脊髓损伤后炎性细胞浸润及组织水肿的程度,其疗效随剂量增加而增加。结论:N6复合剂可以减轻脊髓全横断损伤后脂质过氧化反应所造成的损伤,减少凋亡发生,从而减轻继发性损伤保护受损脊髓,且疗效随剂量增加而增加。