免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的分析免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(VISTA)、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2(HHLA2)在子宫内膜癌(EC)中的表达及临床意义。方法选取2017年9月至2019年10月唐山市妇幼保健院收治的120例的EC患者作为研究对象,收集其的EC组织和癌旁正常组织。检测EC组织和癌旁正常组织VISTA、HHLA2的表达;采用Spearman分析免疫检查点VISTA、HHLA2的相关性;Kaplan-Meier分析VISTA、HHLA2与预后的关系;Cox回归分析影响EC患者预后的危险因素。结果EC组织中VISTA、HHLA2阳性表达率显著高于正常癌旁组织(P<0.05)。Spearman相关性结果显示EC组织中VISTA与HHLA2表达呈正相关性(r=0.587,P<0.05)。EC组织中VISTA、HHLA2表达与临床病理特征有关(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线结果显示VISTA阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=11.864,P<0.05),HHLA2阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=4.975,P<0.05)。Cox回归分析结果显示VISTA和HHLA2是影响EC患者预后的危险因素(P<0.05)。结论免疫检查点VISTA、HHLA2在EC中高表达,其是影响EC预后的危险因素,二者可能是有价值的预后标志物。

单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白基因腺病毒载体构建及其在体内外表达效力检测

目的:构建携带小鼠源性单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(mSIGIRR)基因重组腺病毒并对其体内外表达效力进行检测。方法:构建重组穿梭质粒pDC316-mSIGIRR,行酶切、测序鉴定。将穿梭质粒和骨架质粒共转293细胞,包装重组腺病毒Ad.mSIGIRR,行PCR及滴度鉴定。Ad.mSIGIRR感染A549细胞及小鼠肺组织后,通过RT-PCR、Western blot、免疫组化检测mSIGIRR表达情况。结果:扩增得到目的基因片段与Genbank中序列一致,获得表达mSIGIRR蛋白的重组腺病毒。病毒感染滴度为4×109pfu/mL,在体内外感染模型中均有较高表达效力。结论:成功构建携带mSIGIRR基因重组腺病毒,为进一步研究SIGIRR在炎症调控中的作用及分子机制奠定基础。

外周血T细胞白细胞相关免疫球蛋白样受体1的表达与宫颈上皮内瘤变Ⅲ级及宫颈癌患者高危型人乳头瘤病毒感染的关系

目的研究外周血T细胞白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)的表达与宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ)和宫颈癌患者高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的相关性。方法回顾性分析海口市妇幼保健院2017年1月至2020年3月收治的92例CINⅢ患者(A组)、87例宫颈癌患者(B组)、90例健康志愿者(对照组)的相关资料,对比三组外周血T细胞LAIR-1的表达,统计A组和B组HPV的感染情况,对比A组和B组中HR-HPV感染者与无HR-HPV感染者外周血T细胞LAIR-1的表达,分析A组和B组外周血T细胞LAIR-1的表达与HR-HPV感染的关系。结果对照组的CD3^(+)CD4^(+)T细胞LAIR-1的表达明显较A、B两组低,同时B组的表达显著高于A组(P<0.05);A、B组的CD3^(+)CD8^(+)T细胞LAIR-1表达与对照组比较无明显差异(P>0.05)。B组多重感染、双重感染和HR-HPV单一感染率明显高于A组,同时A组患者的HPV16、HPV18、HPV52感染率均低于B组(P<0.05)。A、B组HR-HPV感染者中的CD3^(+)CD4^(+)T细胞LAIR-1表达明显高于未感染HR-HPV者(P<0.05);A、B组未感染HR-HPV者的CD3^(+)CD8^(+)T细胞LAIR-1表达与HR-HPV感染者比较无明显差异(P>0.05)。A组和B组CD3^(+)CD4^(+)T细胞LAIR-1的表达与HR-HPV感染均呈正相关(r=0.741、0.803,P=0.012、0.005),CD3^(+)CD8^(+)T细胞LAIR-1的表达与HR-HPV感染均无相关性(P>0.05)。结论CINⅢ和宫颈癌患者CD3^(+)CD4^(+)T细胞LAIR-1的表达与HR-HPV感染呈正相关性,且CD3^(+)CD4^(+)T细胞LAIR-1的表达可作为病情分级的预测指标。

带状疱疹患者皮损程度与血清免疫球蛋白水平和NLRP3炎性小体水平的相关性研究

目的:探究带状疱疹(Herpes zoster,HZ)患者皮损程度与血清免疫球蛋白水平和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小体水平的相关性。方法:选取2018年11月-2020年11月就诊于笔者医院的100例带状疱疹患者,根据皮损程度分为轻度组31例、中度组53例和重度组16例。检测并比较各组免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)水平;NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)水平;Pearson相关系数分析皮损程度与IgA、IgG、IgM、NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA相关性。结果:与轻度组比较,中度组和重度组Ig A、Ig G、Ig M显著降低,重度组显著低于中度组,差异有统计学意义(P<0.05);与轻度组比较,中度组和重度组NLRP3、Caspase-1 mRNA水平显著升高,重度组显著高于中度组,差异有统计学意义(P<0.05)。患者皮损程度与IgA(r=-0.221、-0.253、-0.437,P<0.05)、IgG(r=-0.314、-0.361、-0.392,P<0.05)、IgM(r=-0.436、-0.504、-0.696,P<0.05)呈负相关,与NLRP3mRNA(r=0.231、0.261、0.514,P<0.05)、Caspase-1mRNA(r=0.601、0.371、0.324,P<0.05)呈正相关。结论:带状疱疹患者皮损程度与血清免疫球蛋白和NLRP3炎性小体具有密切的相关性,对临床诊治带状疱疹有着一定的参考价值。

抑制性受体TIGIT在慢性病毒感染中的作用机制研究进展

T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域[T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyro?sine-based inhibitory motif(ITIM)domain,TIGIT]是新型T细胞或NK细胞抑制性受体,可通过与肿瘤细胞、被感染细胞表面的多种配体相结合,激活免疫细胞内部负性刺激信号,从而抑制细胞过度活化和促炎性细胞因子的过度分泌,在肿瘤、病毒感染以及多种自身免疫病的免疫发病机制中发挥重要的调节功能。阐明TIGIT在免疫应答中的机制将有助于揭示多种疾病免疫应答中的T细胞功能低下,为多种疾病的治疗提供新的思路和靶点。我们就TIGIT在慢性病毒感染中的作用机制的最新研究进展做简要综述。

免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立

目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果:酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论:成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。

小鼠SIGIRR基因重组腺病毒的构建及鉴定

拟构建小鼠SIGIRR基因重组腺病毒并进行鉴定,为SIGIRR在小鼠急性肺损伤预防及治疗方面的研究提供基础。利用AdEasyTM系统构建SIGIRR基因重组腺病毒,并检测SIGIRR mRNA及蛋白在感染细胞及组织中的表达。通过多次扩增后,大量制备高滴度腺病毒。结果表明,本试验成功构建了携带小鼠源性SIGIRR基因的重组腺病毒表达载体Ad-mSIGIRR,病毒感染滴度为5×1010 pfu/mL,滴度符合下一步试验要求。Western blot和免疫组化方法分别检测到mSIGIRR在体内的高效表达,且经气管滴注感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。明确了SIGIRR基因的重组腺病毒可以在小鼠活体内使mSIGIRR过表达,且经气管滴注5×109pfu的病毒感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。

IgA肾病患者血清外泌体中NLRP3的表达及与疾病严重程度的相关性

目的 :观察免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)肾病患者血清外泌体中炎症小体NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)的表达变化,分析其与疾病严重程度的相关性。方法:选取2018年1月—2019年12月在南通大学附属医院肾活检为原发性IgA肾病患者60例,根据肾脏病理Katafuchi积分分为4组:0~3分17例、4~6分19例、7~9分15例、10~12分9例;另选择因肾良性肿瘤行手术切除患者15例为对照组。收集IgA肾病患者血清外泌体,免疫组化试剂盒检测外泌体中NLRP3的表达,Pearson相关分析法分析血清外泌体NLRP3的表达与Katafuchi积分、24 h尿蛋白定量、内生肌酐清除率的相关性,并分析血清外泌体NLRP3的表达与肾组织内NLRP3表达的相关性。结果 :IgA肾病患者血清外泌体中NLRP3的表达明显高于对照组(P<0.05),其表达水平与蛋白尿、Katafuchi积分呈正相关(P<0.05),与内生肌酐清除率呈负相关(P<0.05)。IgA肾病患者肾脏组织内NLRP3的表达较对照组明显升高(P<0.05),且与血清外泌体中NLRP3的表达呈正相关(P<0.05)。结论:IgA肾病患者血清外泌体中NLRP3的表达与疾病的严重程度呈正相关,可能参与疾病的发生及发展。

传染性单核细胞增多症患儿外周血B淋巴细胞中免疫抑制因子的表达及意义

目的观察4种免疫抑制因子〔程序性死亡受体-1(PD-1)、程序性死亡受体-1配体(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、含T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)〕在传染性单核细胞增多症(IM)B淋巴细胞上的表达水平及临床意义。方法以2017年4月—9月湖南省儿童医院收治的IM患者为研究对象(IM组),急性期59例,恢复期34例,20例健康体检儿童为正常对照组。采用流式细胞术分别检测PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT在各组B淋巴细胞上的表达水平及急性期表达量与血浆/血清EBV-DNA含量的相关性。结果与正常对照组比较,IM急性期组患者的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT在B细胞上均显著升高〔PD-1:5.22(3.15)%比0.76(0.86)%,PD-L1:7.80(5.29)%比0.87(0.09)%,CTLA-4:4.23(6.21)%比0.52(0.28)%,TIGIT:9.78(5.72)%比2.23(1.05)%,均P<0.05〕。IM恢复期组PD-L1、TIGIT在B细胞上的表达较正常对照组明显升高〔PD-L1:4.43(6.27)%比0.87(0.09)%,TIGIT:6.03(5.46)%比2.23(1.05)%,均P<0.05〕,但其升高程度明显低于急性期组(均P<0.05)。对急性期59例患者抽血查EBV-DNA检测结果为(8.44±2.04)×10~5拷贝/mL。相关性分析显示,IM患者急性期TIGIT在B细胞上表达水平与EBV-DNA含量呈正相关(r=0.371,P=0.006);而其余3个指标则无相关性,PD-1:r=0.049,P=0.723;PD-L1:r=0.068,P=0.625;CTLA-4:r=0.662,P=0.659。结论PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT在IM急性期表达上调,随着疾病恢复而表达有所下降,提示在IM发病中有一定作用;同时急性期TIGIT表达水平与血浆/血清EBV-DNA含量高低有关。

用于肿瘤治疗的免疫检查点及其抑制剂研究进展

肿瘤免疫检查点的发现为肿瘤免疫治疗提供了全新的思路。除了传统免疫检查点细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、程序性死亡蛋白1(PD-1)之外,T细胞免疫球蛋白和黏蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3/CD223)、具有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域的T细胞免疫球蛋白(TIGIT)、B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、含免疫球蛋白V结构域T细胞活化抑制因子(VISTA)等新型免疫检查点也逐渐被发现,极大的丰富了肿瘤免疫治疗的选择维度。与之相关的免疫检查点抑制剂如CTLA4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab), PD-1/PD-1配体1(PD-L1)抑制剂纳武单抗(nivolumab)、帕姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)等相继问世,其在黑素瘤、非小细胞肺癌、消化道肿瘤等实体瘤的治疗方面获得了极大的成功。然而,免疫相关不良事件、耐药性等问题也应该引起足够的重视。本文主要对免疫检查点、免疫检查点抑制剂及其在恶性肿瘤中的应用等方面的研究进展进行综合评述。

NLRP3炎症小体通过T细胞亚群参与IgA肾病发病机制的研究进展

免疫球蛋白(Ig)A肾病是原发性肾小球疾病的一种常见类型,部分可进展为终末期肾病。IgA肾病的主要病理特征是以IgA为主的免疫复合物沉积于肾小球系膜区。IgA肾病的发病机制目前仍不明确,近年研究报道NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体激活、细胞因子分泌和T细胞亚群分化在IgA肾病的发病过程中发挥着重要作用。本文综述了NLRP3炎症小体和T细胞亚群分化在IgA肾病发展过程中的作用,以期为IgA肾病发病机制的研究及新治疗靶点的探索提供思路。

靶向抗TIGIT和PVRIG双特异抗体的制备及体外生物性活性的研究

目的制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus receptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性。方法用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG细胞和293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度。结果SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度>95%;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95。采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均>90%。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.16870μg/mL和0.03865μg/mL,与293T-cyno-PVRIG cell line的EC 50分别为0.03714μg/mL和0.03198μg/mL,与Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为1.74E-10M和1.69E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和TIGIT的人源化抗体hT1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.07027μg/mL和0.03121μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line的EC 50分别为0.02028μg/mL和0.02822μg/mL;与Human TIGIT Protein,His Tag的亲和力为8.50E-10M和8.47E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有阻断PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG相互作用活性,且KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV的EC 50为0.007μg/mL,优于单独人源化抗体hT1(EC 50为0.013μg/mL)和hP1(EC 50为0.048μg/mL)的作用。在含pp65 peptide条件下KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体分泌IFN-r为349.72 pg/mL,明显高于其他抗体。结论KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物。

可溶型LAIR分子与肾移植术后巨细胞病毒肺炎的关系

目的探讨可溶型LAIR分子（sCD305，CD306）与。肾移植术后巨细胞病毒（CMV）肺炎的关系。方法肾移植受者血清19份，分为肺炎组（10份）和对照组（9份）；以夹心ELISA方法定量检测血清中sCD305和CD306的浓度；用CHISS软件进行t检验。结果2组sCD305浓度均不符合正态分布，肺炎组波动于0．000-3．039μg／L，对照组波动于0．000～8．375μg／L；肺炎组CD306浓度不符合正态分布，波动于0．000～0．017μg／L，对照组符合正态分布，浓度为（0．046±0．035）Mg／L，CD305在CMV肺炎患者血清内的表达降低，与对照组相比差异有统计学意义（P=0．000），而sCD305在2组的表达差异无统计学意义（P=0．316）。结论CD306在肾移植术后发生CMV肺炎的患者血清内表达明显降低，CMV—PP65抗原检测联合CD305检测，有助于临床准确早期诊断CMV肺炎。

基于VSIG4/NLRP3炎症复合通路探讨异甘草素对中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症的影响

目的探讨异甘草素对中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症的影响及其可能的作用机制。方法用卵清蛋白建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型。将Balb/c小鼠随机分为对照组(给予等量的0.9%NaCl处理)、模型组(卵清蛋白建模)、地塞米松组(腹腔注射4 mg·kg^(-1)的地塞米松)、低剂量实验组(腹腔注射100 mg·kg^(-1)的异甘草素)、高剂量实验组(腹腔注射200 mg·kg^(-1)的异甘草素),每组11只。在最后1次雾化激发后的24 h内,检测各组小鼠气道阻力后处死小鼠取支气管肺泡灌洗液及肺组织。用细胞计数板进行总细胞计数;用瑞氏-吉姆萨染色法进行细胞分类计数;用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测支气管肺泡灌洗液炎性因子水平;用蛋白质印迹法检测肺组织蛋白表达水平。结果对照组、模型组、地塞米松组、低剂量实验组、高剂量实验组的气道阻力值分别为(0.84±0.08)、(3.34±0.34)、(1.23±0.15)、(2.47±0.19)和(1.54±0.18)cmH_(2)O·s^(-1),白细胞总数分别为(15.03±0.11)、(331.20±26.64)、(38.73±3.28)、(180.35±16.89)和(82.74±10.51)×10^(4)·mL^(-1),白细胞介素17(IL-17)水平分别为(4.79±0.58)、(19.21±2.39)、(6.35±0.81)、(15.96±1.10)和(9.04±0.65)pg·mL^(-1),含V型集和免疫球蛋白结构域4(VSIG4)蛋白表达水平分别为0.67±0.04、0.24±0.04、0.59±0.06、0.37±0.04和0.53±0.05,NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)蛋白表达水平分别为0.24±0.02、0.74±0.07、0.35±0.04、0.65±0.08和0.44±0.03。模型组的上述指标与对照组比较,地塞米松组、低剂量实验组、高剂量实验组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论异甘草素可能通过调节VSIG4/NLRP3复合炎性通路,降低气道阻力、抑制炎性介质的释放改善中性粒细胞哮喘小鼠气道炎性。

免疫检查点分子在慢性HBV感染中对T细胞功能影响的研究进展

阻断免疫检查点分子的信号通路可以增强免疫系统功能,这在肿瘤治疗中获得了显著效果。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染的原因之一为HBV在体内通过一系列方式来减弱、抑制免疫系统的功能,从而逃避免疫识别和杀伤。HBV可以通过上调病毒特异性T细胞表面的抑制性受体来抑制T细胞活化、增殖和效应。本文总结了HBV导致的人体内T细胞上免疫检查点程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3,Tim-3)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)的异常表达以及它们影响T细胞功能的机制,揭示了免疫检查点在治疗慢性乙肝中的良好应用前景。