重组脊髓灰质病毒载体研究进展

重组脊髓灰质病毒载体研究进展中国医学科学院医学生物学研究所彭小忠综述戴长柏郭仁审校自１９５５年Ｓａｌｋ灭活疫苗和１９６０年Ｓａｂｉｎ减毒活疫苗应用于人群预防接种以来，该病已在世界范围内得到有效控制［１］。３０多年来的实践证明，Ｓａｂｉｎ减毒活疫苗为一...

免疫缺陷病相关疫苗衍生性脊髓灰质炎4例病例系列报告

背景目前在我国关于免疫缺陷病相关疫苗衍生性脊髓灰质炎(iVAPP)的病例报道少见。目的总结iVAPP的临床表现、免疫学指标及转归。设计病例系列报告。方法纳入2018年5月至2023年6月在复旦大学附属儿科医院临床免疫科住院的iVAPP患儿,截取患儿的人口学资料、接种脊髓灰质炎病毒(PV)疫苗的相关情况、临床表现、发病时免疫相关指标、病原学检测结果、治疗、转归和肌力恢复情况。主要结局指标临床表现和免疫相关指标。结果4例iVAPP患儿均为男孩,发病年龄为7~12月龄,处于口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)4~7个月后;首剂均在3月龄接种OPV,例1、2、4分别接种OPV 1、2、3剂,例3接种OPV 2剂、灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)1剂。2例为联合免疫缺陷病相关疫苗衍生性脊髓灰质炎(CID-VAPP),因“肺部感染、腋下淋巴结破溃”入院,T、B细胞数量均严重降低,呈现多部位肢体瘫痪,存在多侧肢体的肌力减退,积极治疗后未发生缓解;感染累及部位多,感染病原种类多,均发生卡介苗相关结核分枝杆菌感染、重症肺炎,在1周岁内因严重感染死亡。2例为原发性抗体缺陷病(PAD)-VAPP,因“肢体活动障碍”入院,仅B细胞数量降低和抗体分泌障碍,肢体瘫痪症状可累及一侧或双侧,经治疗后肌力可恢复正常,且感染症状轻,预后良好。结论CID和PAD患儿口服OPV均有可能导致iVAPP,患儿的预后主要取决于原发病。

脊髓灰质炎病毒Ⅰ型单克隆抗体的制备

目的:为建立脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特异的单克隆抗体.方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠.取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化.用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价.结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体.间接ELISA法测得单抗的效价为1:8,中和试验测得中和抗体的效价为1:58.结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株Ⅰ型特异的单克隆抗体.

中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎病毒疫苗株VP1区基因变异的研究

为研究中国急性弛缓性麻痹 (AFP)病例中脊髓灰质炎 (简称脊灰 )病毒分离株的分子特征 ,为中国继续维持“无脊灰野毒状态”提供理论依据 ,对 2 0 0 2年所有省级疾病预防控制中心送检的脊灰分离株 ,用PCR RFLP法及ELISA法进行型内鉴定。用PCR RFLP法筛查出与疫苗株相比有异常酶切图谱的毒株共 2 4株 ,其中Ⅰ型毒株 1株 ,Ⅱ型毒株 2 1株 ,Ⅲ型毒株 2株 ;用ELISA法筛查出与疫苗株相比有不同的抗原抗体反应的毒株共 2 2株 ,其中Ⅰ型毒株 7株 ,Ⅱ型毒株 4株 ,Ⅲ型毒株 1 1株 ,在 7株Ⅰ型毒株中有 3株为非疫苗类似株 (NSL) ,其余为双反应毒株 (DRV)。随后对这 4 6株毒株进行了全VP1区的基因序列分析。结果表明 :2 0 0 2年脊灰分离株都是疫苗株或疫苗衍生株 ,没有发现野毒株 ,中国继续保持着“无脊灰野毒状态” ;口服减毒活疫苗 (OPV)株与其它野毒株在稳定性性质方面是类似的 ,即通常是不稳定的 ,在人体肠道内有很强的选择性 ;在人体肠道内 ,病毒复制产生的基因变异导致毒力升高 ,是引起疫苗相关麻痹病例 (VAPP)的重要原因 ,但宿主本身的因素也有很大的作用 ;在局部地区有疫苗株的循环或脊灰疫苗衍生株 (VDPV)的存在 ;最终消除疫苗株引起的AFP病例可能还需要脊灰灭活疫苗(IPV)的介入。

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析

从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒，在ＷＰ１编码区，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定，并经核酸测序进一步证实为疫苗株。其中５株为Ⅰ型疫苗株，１６株Ⅱ型疫苗株，１１株Ⅲ型疫苗株。以同样的分析方法检测这些毒株基因组的３Ｄ聚合酶编码区，发现２株Ⅰ型疫苗株在３Ｄ区的４３１个核苷酸序列为野毒序列，即这２株为Ｓａｂｕｎｌ因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）重组株；其余３株Ⅰ型疫苗株未发现基因重组，１６株Ⅱ型疫苗株中１１株为Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与Ｓａｂｉｎ３基因型（３Ｄ）重组株，３株为Ｓａｉｂｎ２基因型（ＶＰ１）与（Ｓａｂｉｎ１＋Ｓａｂｉｎ２）基因型（３Ｄ）重组株，其余２株未发现基因重组。１１株Ⅲ型疫苗株中只有１株发生重组，为Ｓａｂｉｎ３基因型（ＶＰ１）与Ｎｏｎ－Ｓａｂｉｎ基因型（３Ｄ）重组株。另外，对５＇末端非编码区与神经毒力相关的关键位点（Ⅰ型的４８０－Ｇ和５２５－Ｕ，Ⅱ型的４８１－Ａ及Ⅲ型的４２２－Ｕ）基因的检测发现，５株Ⅰ型疫苗株中，１株在位点５２５－Ｕ突变，碱基Ｃ置换Ｕ；３株在位点４８０－Ｇ突变，碱基Ａ置换Ｇ；另１株未发现突变。１６株Ⅱ型疫苗株均在位点４８１－Ａ突变，碱基Ｇ置换Ａ。

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因特征及其神经毒力的初步观察

中国脊髓灰质炎（脊灰）病毒疫苗株普遍存在基因变异的现象，如重组、点突变等〔１〕。我们选出１０株有代表性的变异株，在具有人脊灰病毒受体基因的转基因小鼠ＰＶＲ－Ｔｇ２１〔２〕中做毒力分析，发现Ｓａｂｉｎ１基因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）的重组株显示很强的神经毒力，其ＰＤ５０ｉｎＴＣＩＤ５０（简称ＰＤ５０）值为４．５，而Ｓａｂｉｎ１标准株的ＰＤ５０值大于８．０。另外两株Ⅰ型疫苗株只在关键性核苷酸位点发生突变，只在位点５２５－Ｕ发生突变的一株，其ＰＤ５０值为５．０，另一株在位点４８０－Ｇ及２７９５－Ａ突变，其ＰＤ５０值为５．８，均显示较强的神经毒力。一株Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与Ｓａｂｉｎ３基因型（３Ｄ）的重组株，其神经毒力（ＰＤ５０≥５．９）亦明显高于Ｓａｂｉｎ２标准株（ＰＤ５０＞７．５）；而１株Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与（Ｓａｂｉｎ１＋Ｓａｂｉｎ２）基因型（３Ｄ）重组株的神经毒力（ＰＤ５０＝７．５０）无明显提高。对Ⅲ型疫苗株的神经毒力分析发现，１株Ｓａｂｉｎ３基因型（ＶＰ１）与Ｎｏｎ－Ｓａｂｉｎ基因型（３Ｄ）重组株的神经毒力，高于仅在核苷酸位点４７２－Ｕ突变的一株疫苗株。值得提出的是，另一株Ⅲ型疫苗?

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。

贵州省贞丰县疫苗衍生脊髓灰质炎病毒循环的病毒学分析

为及时发现和阻断疫苗衍生脊髓灰质炎(脊灰)病毒(vaccine-derived polioviruses, VDPVs)循环、脊灰野病毒的输入和能够引起临床脊灰的其它脊灰疫苗相关病毒,做好贵州省无脊灰状态下脊灰病毒学监测工作,采用病毒分离、鉴定与核苷酸序列测定和分析方法,对贵州省贞丰县及周围10个县2003～2004年报告的急性弛缓性麻痹(AFP)病例及2004年接触者粪便标本的病毒学监测的结果进行了分析. 对收集到的105例AFP病例和47例密切接触者的278份便标本进行了病毒学监测,结果从66例中共分离到肠道病毒(EV)66株,阳性率为43.4%,其中脊灰病毒(PV)29例,分离率为19.1%,非脊灰肠道病毒(NPEV)37例,分离率为24.3%.29例PV经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室鉴定,24例为疫苗相似株,5例为脊灰Ⅰ型VDPVs,这5例均为2004年从贞丰县所分离到.贞丰县及周围县EV阳性检出率(43.4%)高于2003～2004年全省水平(22.9%～24.6%),2004年PV分离率比2003年高达2.6倍,29株PV中单个Ⅰ型占34.5%,明显高于往年(2000～2002年全省平均4.1%).本研究提示,Ⅰ型VDPVs在贞丰县引起了循环(cVDPVs),通过口服脊灰疫苗强化免疫已经阻断cVDPVs的传播.人群中PV和NPEV带毒率明显增高,非VDPVs引起的临床符合脊灰病例不容忽视;应加强脊灰病毒学监测数据的分析和早期疫情预警工作.

应用二倍体细胞培养脊髓灰质炎病毒适宜条件的研究

目的 为用KMB17细胞制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗提供适宜条件。方法 检测不同培养液、不同代次、不同细胞龄和不同病毒感染量等因素对病毒滴度及产量的影响。结果 细胞对脊髓灰质炎病毒的敏感性随细胞龄的增加而降低，培养后24、48、72和96h单个细胞中脊髓灰质炎病毒产量分别为986、745、594和237 Lo-．gTCID50；细胞感染脊髓灰质炎病毒后出现细胞病变时间跨度大于48h，早期从病变细胞释放出的病毒在培养上清中不稳定，感染性滴度每24h降低0．25 LogTCID50以上。结论 KMB17细胞培养脊髓灰质炎病毒的感染性滴度和产毒量受培养液营养成分和病毒接种时细胞龄等条件的影响。

四种消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活效果的研究

为了解二氯异氰尿酸、次氯酸钠、二溴海因、碘伏等4种消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活效果、采用悬液定量试验法进行了实验室观察并与大肠杆菌杀灭效果作比较。结果,含有效氯300 mg/L次氯酸钠和二氯异氰尿酸消毒液分别作用15 m in和30 m in,对脊髓灰质炎病毒灭活对数值均达4.00以上;对大肠杆菌分别作用5和10 m in,杀灭对数值为5.0。含有效溴500 mg/L的二溴海因消毒液作用15 m in,对脊髓灰质炎病毒的杀灭对数值达4.00以上;对大肠杆菌杀灭对数值达到5.0需有效溴200 mg/L作用5 m in。含有效碘500 mg/L的碘伏消毒液作用60m in,对脊髓灰质炎病毒的杀灭对数值达4.00以上;含有效碘200 mg/L作用15 m in,即可杀灭大肠杆菌达5个对数值以上。结论,4种消毒剂对脊髓灰质炎病毒均有较好的灭活效果,且显示脊髓灰质炎病毒比大肠杆菌抗力强;4种消毒剂中,以碘伏对脊髓灰质炎病毒灭活作用最慢。

贵州省疫苗衍生脊髓灰质炎病毒循环事件的调查

目的:掌握应对2004年中国贵州省贞丰县首次Ⅰ型疫苗行脊髓灰质炎病毒循环(cVDPV)事件主要开展的工作。方法:对贵州省疾病预防控制中心(CDC)cVDPV事件现场调查资料进行描述性分析。结果:2004年发生贵州省黔西南布依族苗族自治州(黔西南州)贞丰县发生了Ⅰ型cVDPV,在中国尚属首次。现场调查、现场诊断以及实验室检验结果表明,本次疫情共发现实验室确诊VDPV病例2例,在2例确诊病例的3名健康儿童接触者及1例高危AFP病例的1名健康儿童接触者分离到VDPV。结论:低脊灰质炎减毒活疫苗(OPV)接种率,仍然是本次cVDPV发生的最主要原因。对cVDPV事件所采取的AFP病例主动搜索、OPV强化免疫等措施是有效的,成功的阻断了cVDPV。

我国首例iVDPV病例Ⅱ型脊髓灰质炎病毒分离株的基因特征

对分离于我国首例iVDPV病例的Ⅱ型脊髓灰质炎病毒分离株的基因特征进行了研究。随机选择CHN9230-F3-Ⅱ株为研究对象,将其VP1区RT-PCR产物连接到T载体上进行克隆,随机挑选45个阳性克隆进行序列测定后获得45条VP1区核苷酸序列,这45条序列的VP1基因与昆明Ⅱ型疫苗株VP1基因差异13-24个核苷酸,变异率为1.44%-2.66%。45条序列在同源进化树图上分为3组,但都来源于CHN9230-F3-Ⅱ株,组成以优势株为主的相关突变株的病毒群,是典型的居群样存在形式。经RT-PCR后直接进行序列测定,并根据序列图中优势峰判读结果得到的CHN9230-F3-Ⅱ株核苷酸序列位于序列数量最多的第2组中,然而没有任何一条序列与之完全相同,说明它可能并不能代表具体的某一种序列,而只能是代表主序列具有的一般特征。3个组中的核苷酸序列与Ⅱ型疫苗株相比平均变异率分别为97.50%、97.93%和98.31%,根据脊灰病毒的进化率和3个组VP1区核苷酸序列的变异率推测,患者共5次服脊灰减毒活疫苗（OPV）史中的前3次OPV中的Ⅱ型疫苗病毒存活下来,依照疫苗接种顺序,分别形成了第1组、第2组和第3组的病毒居群样存在形式。我国Ⅱ型iVDPV以复杂的居群样形式存在,由于其进化速率较快并且感染了免疫缺陷患者,使其在该患者体内形成了持续性感染,它已经并可能将在更长的时间内在患者体内持续存在,一旦将来我国停止使用OPV后,iVDPV病例长期持续向外环境中排毒将对我国“维持无脊灰”带来严峻的挑战。

PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒

目的 建立一种简便、有效的从细胞培养物中纯化PV1病毒的方法用于水病毒消毒实验 .方法 PV 1 Henan株在 Hep- 2细胞中增殖后用聚乙二醇 (PEG) 6 0 0 0沉淀结合差速离心的方法纯化病毒 .RT- PCR和透射电镜 (TEM)鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性 .结果 p H值 7.5时终浓度 70 g· L- 1的 PEG6 0 0 0沉淀病毒的感染性回收率(PFU计数 )为 79.2 % ,提纯系数 (PF)为 1 0 6 ,再经差速离心(1 6 0 0 0 g30 m in,1 0 0 0 0 0 g4.5 h)浓缩病毒的感染性回性率和提纯系数分别为 2 9.0 %和 1 6 8.RT- PCR和 TEM最终鉴定提纯物为 PV 1 Henan株 .结论 PEG 6 0 0 0结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作 ,且比单独PEG沉淀有更高的纯化系数 ,是一种简便、有效的方法 .

在我国流行的脊髓灰质炎中发现脊灰病毒Ⅰ型自然重组株

脊髓灰质炎病毒(PV)是引起脊髓灰质炎的最主要的病毒。我们在研究PV1野毒株的分子流行病学时,发现了一株PV1自然重组病毒。用Sabin 1特异PCR检定该毒株基因组2505～2601区段,或用两个Sabin 1特异RNA探针分别打点杂交检定641～740和2502～2575区段时,推断它可能为野毒株;而测定VP1/2A连接区段3296～3445序列时,又表明它为疫苗株。向5′端扩大测序,从3262起的5′侧有与我国PV1野毒株相同的许多核苷酸取代,证明它为野毒株和疫苗株的重组病毒,重组位点为3262/3263。实验中建立了检测该重组病毒的特异的PCR方法。检测我国10个省市、自治区47份PV1分离株中,5个省区14份麻痹病例由重组病毒感染引起。这些重组株在我们测序的3155～3445区段序列彼此几乎相同(同源性≥96.7％),推断它们可能是某病儿受野毒株、疫苗株双重感染产生重组病毒后的子代病毒。有关该重组病毒的毒力、免疫原性、传播性等正在进一步研究中。

脊髓灰质炎病毒冻干保护剂的筛选

目的筛选脊髓灰质炎病毒冻干保护剂。方法将不同配方的冻干保护剂与脊髓灰质炎病毒(SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型)混合,进行冻干,并检测冻干前后病毒感染性滴度及冻干后的热稳定性。结果经检测发现,第Ⅷ组配方(海藻糖8%、人白蛋白1%、山梨醇5%、明胶0·5%和甘氨酸1%)在脊髓灰质炎病毒的冻干过程中保护作用较好。冻干前后感染性滴度下降在0·5LgCCID50/ml以内,且热稳定性好,37℃放置1周后SabinⅠ型、SabinⅡ型及中Ⅲ2型病毒的感染性滴度平均下降分别为0·2、0·3和0·4LgCCID50/ml,而相应对照组的感染性滴度平均下降分别为1·1、1·1和1·3LgCCID50/ml,二者差异有显著意义(P<0·05)。结论含有海藻糖、人白蛋白、山梨醇、明胶和甘氨酸的保护剂对脊髓灰质炎病毒冻干具有良好的保护效果。

氯灭活水中脊髓灰质炎病毒机制的研究

目的探讨氯对脊髓灰质炎病毒核酸和衣壳蛋白的破坏在灭活病毒中的作用,并对病毒基因组受损区域进行定位,阐明氯灭活脊髓灰质炎病毒的机制。方法以不同剂量(0.1、0.5、1.0、1.5和2.0mg/L)的有效氯对脊髓灰质炎病毒作用不同时间(0、15、30、45和60min),采用大片断逐步步移PCR(long-overlapping PCR)分析氯对病毒全基因组的损伤,以ELISA技术分析氯对病毒衣壳蛋白的破坏,以细胞培养检测病毒感染性。结果脊髓灰质炎病毒各部分对氯的抵抗力强弱存在如下关系:病毒衣壳>基因组蛋白编码区>基因组5′端非编码区(noncoding region,NCR)>基因组3′端NCR>poly A尾;脊髓灰质炎病毒的polyA尾和3'端NCR破坏可造成病毒的感染性下降,但不能完全灭活病毒;5′端NCR的破坏与病毒感染性的消失一致,损伤区域主要位于富含二级结构的区域。结论氯主要通过破坏脊髓灰质炎病毒核酸而非衣壳蛋白灭活病毒;病毒基因组5′NCR内二级结构区域的破坏对脊髓灰质炎病毒具有致死效应。

脊髓灰质炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法的应用与发展

1996年美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR技术,该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1-2]。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,可动态实时检测核酸产物的形成,无需后处理过程,避免了扩增产物的污染,而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭和易操作等优点,因而目前已得到广泛应用[3-4]。

臭氧与紫外线协同灭活脊髓灰质炎病毒效果的研究

为了解臭氧与紫外线协同灭活病毒的效果,采用悬液定量灭活试验进行了实验室观察。结果,以3.0 mg/L臭氧单独作用7 m in,可有效灭活悬液内脊髓灰质炎病毒;以辐射强度85μW/cm2的紫外线,单独作用5 m in,亦可有效灭活脊髓灰质炎病毒。以3.0 mg/L臭氧与紫外线联合作用,仅需要1 m in即可有效灭活悬液内脊髓灰质炎病毒。结论,臭氧与紫外线联合应用,对灭活悬液内脊髓灰质炎病毒具有明显的协同增效作用。

外环境中脊髓灰质炎病毒监测研究

［目的］ 为监测外环境中是否还有脊髓灰质炎 （Ｐｏｌｉｏ） 野病毒株循环。［方法］ 在曾是Ｐｏｌｉｏ 流行区的地区， 于１９９７～１９９８年定点采集０～４岁儿童粪便５３８ 人份， 河塘水８８份， 市自来水厂源水８份和出厂水６份。［结果］ 从粪便和水中分离到ＰＶⅠ型２８株、ＰＶⅡ型１株、ＰＶⅢ型５ 株、ＮＰＥＶ４２株。分离的ＰＶ温度特征试验， 判为弱毒（疫苗） 株； ＲＴ－ＰＣＲ型内分析亦为疫苗（Ｓａｂｉｎ） 相关株。［结论］ 在具有对Ｐｏｌｉｏ高免疫屏障的人群和外环境中， 仍有Ｐｏｌｉｏ 病毒循环， 但均为疫苗相关株。

脊髓灰质炎病毒与F_2噬菌体对部分消毒剂抗力的比较研究

采用悬液定量试验,观察了脊髓灰质炎病毒对过氧乙酸、有机含氯消毒剂、二氧化氯等消毒剂的抗力并与大肠杆菌F2噬菌体作平行比较。结果,过氧乙酸对脊髓灰质炎病毒的灭活对数值>5.00,需要500 mg/L作用30m in;对F2噬菌体的灭活对数值>5.00,需要1500 mg/L作用60 m in。二氧化氯对脊髓灰质炎病毒灭活对数值>5.00,需要200 mg/L作用5 m in;对F2噬菌体灭活对数值>5.00,需要300 mg/L作用5 m in。有机含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活对数值>5.00,需要有效氯500 mg/L作用30 m in;对F2噬菌体灭活对数值>5.00,需要有效氯1000 mg/L作用10 m in。结论,脊髓灰质炎病毒对过氧乙酸抗力明显低于大肠杆菌F2噬菌体;脊髓灰质炎病毒对有机含氯消毒剂和二氧化氯的抗力均略低于大肠杆菌F2噬菌体。