脊髓钝挫伤后慢病毒干扰水通道蛋白4对大鼠运动功能及Rho表达的影响

目的 探讨脊髓钝挫伤(SCC)后,慢病毒干扰水通道蛋白4(AQP4)对大鼠运动功能的影响,并观察凋亡相关因子Rho表达的变化。方法 将SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、生理盐水组(SCC组)、空载组(Vector组)和慢病毒组(AQP4RNAi组,制备慢病毒AQP4干扰模型),每组32只。SCC组、AQP4RNAi组及Vector组均采用改良Allen’s法制备SCC模型,术后12 h及术后1、3 d,采用大鼠脊髓损伤(BBB)评分评估4组后肢运动功能;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组脊髓组织中rho的表达;采用免疫组织化学方法检测Rho在4组脊髓组织中的表达;生物信息学分析预测AQP4与Rho之间的相关性。结果 运动功能评分结果显示,术后12 h SCC组、Vector组和AQP4 RNAi组BBB评分均为0分,术后3 d AQP4 RNAi组BBB评分较Vector组高(P<0.05)。GeneMANIA结果显示,AQP4与Rho存在间接共表达关系。RT-PCR和免疫组织化学结果显示,术后12 h及术后1、3 d AQP4RNAi组脊髓组织中rho表达均低于Vector组(P<0.05);SCC组脊髓组织中rho表达均高于Sham组(P<0.05)。结论 大鼠SCC后脊髓组织中Rho表达上调,而干扰AQP4能使其Rho表达下调,减少神经细胞凋亡,有利于大鼠运动功能恢复。

大鼠脊髓钝挫伤后单核细胞趋化蛋白-1与趋化因子受体2的表达变化

目的:探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和趋化因子受体2(CCR2)在脊髓钝挫伤(SCC)大鼠的表达及其对运动功能和感觉功能的影响。方法:SD大鼠随机分为损伤(SCC组)术后12h、3d、7d、14d组及假手术组共5组。Allen打击法建立SCC模型,进行BBB评分,光热尾痛法测定大鼠温痛觉潜伏期,RT-PCR检测CCR2和MCP-1基因相对表达量,免疫组织化学观察MCP-1和CCR2在脊髓前角和后角的表达。结果:SCC后BBB评分降低,7d与14dBBB评分明显增高。SCC后3、7d温痛觉潜伏期较假手术组缩短。SCC后CCR2mRNA在12h和3d时表达量增高;随后在7、14dCCR2mRNA降低。MCP-1mRNA的表达量在12h、3d、7d增高,14dMCP-1mRNA下降。MCP-1和CCR2在脊髓前角主要表达在神经元中,在脊髓后角主要表达于神经胶质细胞和神经元。结论:MCP-1和CCR2可能作为重要的因子参与脊髓损伤早期的继发性损伤,导致大鼠运动功能和感觉功能障碍。

抑制白细胞介素IL-1β后脊髓钝挫伤大鼠运动功能恢复的研究

目的本实验将研究IL-1β对大鼠脊髓钝挫伤后运动功能的影响,在最大程度保留神经功能的前提下,在临床上对脊髓神经病变提供治疗依据。方法建立脊髓损伤动物模型,BBB评分评价大鼠SCI后后肢的运动功能;采用RT-PCR、WesternBlot、免疫组化对IL-1β基因和蛋白质表达进行定量和定位分析。结果(1)通过BBB评分分析得出IL-1β基因干扰后,大鼠的运动恢复能力较SCI组和SCI+生理盐水组显著提高;(2)SCI+IL-1βRNAi组的IL-1β基因的mRNA的表达显著低于SCI组和SCI+生理盐水组;(3)SCI+IL-1βRNAi组的IL-1β基因的蛋白的表达显著低于SCI组和SCI+生理盐水组;(4)免疫组化实验结果显示组织中SCI+IL-1βRNAi组的IL-1β基因的表达显著低于SCI组和SCI+生理盐水组。结论IL-1β基因被siRNA干扰后,大鼠的运动恢复能力较不做处理的脊髓损伤大鼠有所提高,且提高效果显著,有统计学差异。

大鼠脊髓钝挫伤后IL-6和Vim对运动功能恢复的影响

目的用慢病毒干扰白介素6(interleukin-6,IL-6)的表达,观察脊髓钝挫伤(spinal cord contusion,SCC)后波形蛋白(Vim)的表达变化及其对大鼠运动功能恢复的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组(sham组),SCC实验组(SCC组),载体组(vetor组)和慢病毒组(IL-6-RNAi-LV组)。改良Allen's法制备SCC模型,BBB评分评估术后大鼠的运动功能变化,免疫组织化学技术(IHC)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测IL-6、Vim的蛋白质定位和mRNA的表达变化。Gene MANIA预测IL-6和Vim的关系后构建慢病毒干扰IL-6的SCC模型进一步实验。结果 BBB评分显示SCC组,IL-6-RNAi-LV组,Vetor组在术后5、7、14、28d较Sham组明显下降(P<0.05),而IL-6-RNAi-LV组在第5、7、14、28天的评分较Vetor组有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。IHC结果显示IL-6和Vim表达在脊髓神经元中。另外,IL-6mRNA在SCC后12h达到峰值(P<0.05),Vim mRNA在SCC后7、14、28d较sham组增高,进一步抑制IL-6后其在28d与vector组相比有明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论在SCC后,抑制IL-6表达可以下调Vim,抑制胶质瘢痕形成,进而促进SD大鼠的运动功能恢复。

白细胞介素-10对大鼠脊髓钝挫伤修复的影响及机制研究

目的探究脊髓钝挫伤(SCC)后白细胞介素-10(IL-10)对大鼠脊髓损伤修复以及对睫状神经营养因子(CNTF)表达变化的影响。方法采用Allen′s打击法制备SCC动物模型,BBB评分评估SCC后的运动功能。免疫组织化学技术(IHC)、免疫荧光技术(IF)和实时聚合酶链反应技术(qPCR)检测脊髓中IL-10、CNTF的蛋白定位及基因表达。用慢病毒介导的基因干扰技术抑制IL-10的表达。利用生物信息学方法GeneMANIA分析预测IL-10和CNTF的相互关系。结果与空载组(Vector)相比,IL-10抑制组(RNAi-IL-10)大鼠的BBB评分在第5、7天明显下降(P<0.05)。GeneMANIA分析提示IL-10与CNTF具有相互作用的蛋白质分子结构域。IL-10抑制后,CNTF mRNA表达明显上调(P<0.05)。IHC、IF实验结果表明IL-10和CNTF在脊髓前角灰质的神经元中表达。qPCR的实验结果提示,与假手术组相比,SCC后CNTF与CNTF受体的mRNA表达明显下调(P<0.05)。IL-10 mRNA在SCC后6、12 h明显上调;与6 h组相比,1、3、7、14 d组明显下调(P<0.05)。结论抑制IL-10导致CNTF表达上调,CNTF代偿性增高影响SCC的修复,为脊髓损伤的基因靶向治疗提供了新的视角。

白细胞介素-10通过乙二醛酶1影响脊髓钝挫伤大鼠运动功能的恢复

目的用慢病毒介导的方法抑制白细胞介素-10(IL-10)的RNA,观察IL-10通过乙二醛酶1(GLO1)影响大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。方法SD大鼠66只,采用Allen’s法制备脊髓钝挫伤(spinal cord contusion,SCC)模型,随机分为Sham组(n=9)、SCC组(n=27)、Vector组(n=15)和IL-10 SH组(n=15),分别注射空质粒和包装IL-10 siRNA的质粒;每组再分为3 d、7 d和28 d亚组。采用BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)评分评估大鼠后肢运动功能;免疫组织化学和qRT-PCR技术定位和定量测定IL-10和GLO1的表达变化;用慢病毒包装的RNA构建IL-10的RNA干扰模型(IL-10-SH-LV)评估IL-10和GLO1在脊髓损伤后的功能,GeneMANIA生物信息学预测IL-10和GLO1的关系。结果SCC后大鼠双后肢截瘫,后肢运动功能消失,BBB评分在损伤后1 d,3 d,7 d,14 d逐渐恢复,但低于对照组。qRT-PCR结果显示IL-10在脊髓损伤后表达显著降低;SCC后,免疫组织化学结果显示IL-10主要在脊髓前角的神经元和神经胶质细胞中表达。慢病毒干扰IL-10的表达后,随着时间推移,GLO1表达增加,大鼠运动功能BBB评分也逐渐恢复。GeneMANIA结果显示GLO1和IL-10通过共表达的Hpd和Klk1c2、Kcns1、Proc相互作用。结论IL-10通过上调抗氧化应激因子GLO1的表达促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复。

Real-time PCR检测脊髓钝挫伤大鼠TPM4基因的变化

目的观测TPM4在大鼠脊髓钝挫伤后的基因变化,探讨其在脊髓损伤修复中的作用。方法 SD成年大鼠20只,分为假手术组,脊髓钝挫伤12h组,脊髓钝挫伤3d组,脊髓钝挫伤7d组。取损伤段脊髓,通过Q-PCR检测TPM4的基因含量。结果 Q-PCR结果显示大鼠脊髓钝挫伤后12h,脊髓中的TPM4基因表达开始降低,于损伤后3d达最低,损伤后7d逐渐开始增加,均有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠脊髓损伤后,脊髓中TPM4基因含量变化先降低再升高,提示TPM4可能参与脊髓钝挫伤后的修复。

沉默白细胞介素-1β基因对脊髓钝挫伤大鼠波形蛋白的影响

目的探讨白细胞介素-1β(IL-1β)对大鼠脊髓钝挫伤模型中波形蛋白的影响。方法 Sprague-Dawley大鼠30只,采用Allen法制备脊髓钝挫伤模型,随机分为空载组(n=15)和干扰组(n=15),分别注射空质粒和包装IL-1βsi RNA的质粒;每组再分为3 d、7 d和28 d亚组。通过Gene MANIA预测IL-1β与波形蛋白之间的关系。采用免疫组化和实时定量聚合酶链反应方法观察损伤区波形蛋白的表达。结果 Gene MANIA分析显示,IL-1β与波形蛋白可通过多个基因直接或间接联系。空载组波形蛋白在脊髓前角神经元和神经胶质细胞中广泛表达,干扰组波形蛋白及m RNA均较空载组下降(t>2.875,P<0.05)。结论 IL-1β能调控波形蛋白表达,可能影响损伤修复。

慢病毒介导的RNA干扰下调IL-6抑制脊髓顿挫损伤后Caspase-3表达

目的通过慢病毒介导的RNA技术干扰IL-6的表达,探究脊髓顿挫损伤后Caspase-3的表达变化。方法Allen′s打击法制备脊髓顿挫伤(SCC)模型,BBB评分确认造模成功;免疫组织化学和Q-PCR技术定位和定量测定IL-6和Caspase-3的表达变化;Gene MANIA网站预测IL-6与Caspase-3的联系;慢病毒介导的RNA干扰技术构建IL-6干扰模型后,Q-PCR技术定量测定Caspase-3的表达变化。结果 SCC后SD大鼠BBB评分显著低于假手术组(P<0.05);IHC结果显示:IL-6和Caspase-3均在在脊髓白质胶质细胞表达;Q-PCR结果显示:IL-6在损伤后12h表达显著增加,3d、28d表达持续下降;Caspase-3在损伤后12h、3d、28d表达持续下降。生物信息学分析结果:IL-6和Caspase-3在大鼠体内存在共定位关系。干扰组Caspase-3表达比空载组显著降低(P<0.05)。结论在SCC后,抑制IL-6表达可降低Caspase-3表达水平。

芫花根醇提颗粒联合甲基泼尼松龙对脊髓损伤大鼠BDNF、NMDA表达及行为学的影响

目的研究芫花根醇提颗粒（金腰带）联合甲基泼尼松龙对脊髓损伤（spinal cordinjury,SCI）大鼠行为学、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）表达及N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）水平的影响。方法 SD成年雄性大鼠,随机分为假手术组、脊髓挫伤组（模型组）、金腰带组[灌胃金腰带50 mg/（kg·d）,共5天]、甲基泼尼松龙组（脊髓钝挫伤术后8 h内肌肉注射50 mg/kg甲基泼尼松龙,此后甲基泼尼松龙剂量每天减少10 mg/kg,共5天）及联合组（金腰带和甲基泼尼松龙联合干预）。各组大鼠均在术后（0、3、7、28天）进行后肢行为学评价[神经行为学（Basso Beattie and Bresnahan,BBB）评分]。术后13天,每组取8只大鼠,麻醉后取损伤脊髓T（8-10）液氮中保存,采用[-3H]MK-801放射性配基分析法测定NMDA受体亲和力（Kd）和最大结合数量（Bmax）;取术后28天大鼠损伤脊髓,采用免疫组织化学法检测BDNF表达。结果与假手术组比较,模型组腹角和背角BDNF阳性神经元数量升高,Bmax（470±34）升高,Kd降低,术后3-28天BBB评分降低,差异有统计学意义（P〈0.05）。与模型组比较,各给药组BDNF阳性神经元数量及Kd升高,术后3-28天BBB评分升高（P〈0.05）,Bmax[甲基泼尼松龙组：660±15,金腰带组：646±25,联合组：510±21]降低（P〈0.05）。与甲基泼尼松龙组比较,金腰带组及联合组BDNF阳性神经元数量及Kd升高（P〈0.05）,术后7-28天BBB评分升高（P〈0.05）,Bmax降低（P〈0.05）。与金腰带组比较,联合组BDNF阳性神经元数量及Kd升高（P〈0.05）,Bmax降低（P〈0.05）。结论金腰带能有效改善SCI大鼠后肢运动功能,增加脊髓组织中BDNF的表达,通过影响脊髓NMDA受体减轻脊髓继发性损伤,对SCI有一定的治疗与保护作用,效果优于甲基泼尼松龙且与其有协同作用。

金腰带治疗对大鼠损伤脊髓BDNF、NMDA受体表达及行为学的影响

目的研究中草药金腰带治疗对脊髓损伤(SCI)大鼠行为学、脑源性神经营养因子(BDNF)表达及N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体水平的影响。方法 SD成年雄性大鼠,随机分为假手术组、脊髓挫伤组(SCI组)、脊髓挫伤后金腰带治疗组〔每日1次胃内灌服金腰带50mg/(kg.d),共7次〕。各组大鼠均在术后(0d、3d、10d、28d)进行后肢行为学评价(BBB运动功能评分)。术后13d,每组取8只大鼠麻醉后取损伤脊髓T10液氮中保存,采用[3 H]MK-801放射性配基分析法测定NMDA受体亲和力(Kd)和最大结合数量(Bmax);取术后28d组大鼠损伤脊髓进行免疫组织化学染色,观察BDNF在脊髓的定位及表达变化。结果 BBB评分SCI组大鼠各时间点均低于假手术组(P均<0.05),而金腰带治疗组术后各时间点均高于SCI组(P均<0.05)。SCI后13d,脊髓内NMDA受体Bmax较假手术组增高(P<0.05),金腰带组较SCI组减少(P<0.05);SCI后28d损伤处脊髓腹角、背角BDNF阳性神经元数量较假手术组增加(P<0.05),金腰带治疗组BDNF阳性神经元数量较SCI组进一步增加(P<0.05)。结论金腰带治疗能有效改善SCI大鼠后肢运动功能,增加脊髓组织中BDNF的表达和通过影响脊髓NMDA受体减轻脊髓继发性损伤,对SCI有一定的治疗与保护作用。

脊髓损伤后原肌球蛋白4在脊髓白质的定位及表达

目的研究脊髓钝挫伤(spinal cord contusion,SCC)后,原肌球蛋白4(tropomyosin 4,TPM4)在脊髓的表达和定位,探讨TPM4在脊髓损伤中的作用。方法 SD大鼠随机分为sham组与SCC组,Allen's打击法建立SCC模型,RT-PCR技术检测TPM4 mRNA的表达,IHC技术检测TPM4在白质的定位。结果 SCC组TPM4的表达量在3d下降(P<0.05),7d、14d TPM4的表达量随时间延长有上升趋势,但是仍然低于sham组;TPM4主要表达在神经胶质细胞、神经纤维和血管上。结论 TPM4可能在脊髓钝挫伤神经纤维的修复和重塑中起重要作用。