不同消化方式对脐带华通胶间充质干细胞提取的影响

目的探讨使用不同酶浓度、消化不同时间及不同浓度胎牛血清的培养基稀释对消化脐带华通胶后提取培养间充质干细胞的影响。方法无菌条件下取出正常剖腹产胎儿脐带,剔除动脉、静脉及外膜,取其之间的胶状物,剪成1 mm3及更小的块状,分别加入0.1%和0.2%的Ⅱ型胶原酶,分为A、B两组,37℃水浴消化。每一组消化时间分别为4、81、2、16、202、4、28、323、6、40 h共10个消化时间点,每一个消化时间点又分为两组,分别为A1、A2组和B1、B2组。消化后的黏稠细胞悬液用完全DMEM稀释,并加入特级胎牛血清至浓度为10%(A1、B1)和20%(A2、B2),充分混匀。悬液移至75 cm2培养瓶,15 ml/瓶,37℃、5%CO2、饱和湿度培养,3 d换液。通过细胞计数观察原代细胞贴壁生长的最早时间和80%细胞铺满瓶底的时间和生长活力。结果 0.2%的Ⅱ型胶原酶消化脐带华通胶在消化时间为20h,且稀释血清浓度为20%时,获得的细胞悬液在培养36 h即有细胞贴壁,培养6 d细胞贴壁达到80%,其余各组细胞生长情况各不相等,均弱于此组。其中消化时间在8 h以内和32 h以上时不论使用多少的酶浓度和稀释时使用多少的血清浓度,细胞均不生长。结论在使用胶原酶消化脐带华通胶提取间充质干细胞的过程中,使用0.2%Ⅱ型胶原酶、消化16～24 h、稀释培养时加入至20%的血清对干细胞的提取效果最佳。

人脐带华通胶间充质干细胞的分离培养及标记方法研究

目的 :探讨从人脐带华通胶中分离培养间充质干细胞的方法,并对细胞进行标记,为细胞移植奠定基础。方法:采用组织块贴壁法分离培养人脐带华通胶间充质干细胞并进行传代,观察细胞的形态学特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型;用荧光染料PKH26对获取的细胞进行体外标记,观察标记细胞形态并记录其生长曲线。结果:组织块贴壁法可以成功地从人脐带华通胶中培养出间充质干细胞,并且在连续增殖传代过程中细胞形态未发生明显变化,细胞生长曲线相似;细胞能够高表达基质细胞抗原(CD29、CD90、CD44、CD105),而低表达造血干细胞抗原(CD34、CD45)和白细胞相关抗原(HLA-DR);PKH26可以标记脐带间充质干细胞,显示红色荧光,且标记细胞形态良好,与未标记细胞的生长曲线相似。结论:组织块贴壁法是一种简便有效的分离脐带间充质干细胞的方法;应用PKH26体外标记细胞成功率高、技术稳定。

脐带华通胶间充质干细胞对急性再生障碍性贫血T淋巴细胞亚群的影响

目的体外观察脐带华通胶间充质干细胞(UCWJMSCs)对急性再生障碍性贫血(AAA)患者T淋巴细胞(TLC)亚群的调节作用。方法收集21例AAA患者和10例健康志愿者外周血,制备单个核细胞(MNCs)悬液,UC-WJMSCs和MNCs以一定比例混合共育一定时间后,采用流式细胞仪检测TLC亚群并进行统计分析。结果 AAA患者TLC亚群呈Th1、Tc1极化状态。混合培养后,健康人的TLC亚群未见明显变化(P>0.05);AAA患者的TLC亚群除Th2与Tc2无明显变化外,CD3+、CD8+、CD2+8、Th1和Tc1亚群比例明显降低,而CD4+、CD4+/CD8+、CD5+6、CD2+5和CD1+03亚群比例明显升高(P<0.05)。调节作用24 h就已产生7,2 h时达高峰;调节作用随UCWJMSCs浓度的增高而增强。结论 UCWJMSCs对AAA患者的TLC亚群有明显调节作用,不同个体来源的UCWJMSCs调节作用无区别。

脐带华通胶间充质干细胞移植治疗晚期慢性心力衰竭的手术配合

目的探讨脐带华通胶间充质干细胞移植治疗晚期慢性心力衰竭的护理配合与观察方法的重要性。方法从脐带组织中利用酶消化法提取华通胶间充质干细胞,经静脉推注无菌干细胞悬液,推注速度3～4 ml/min。术中给予心电监护、严密观察患者生命体征及有无变态反应等。结果移植过程中及移植后均无不良反应和并发症发生。6个月后随访患者6 min步行试验、超声心动检查射血分数值增加,临床症状明显改善。结论严格的无菌操作技术、适宜的静脉推注速度和严密的护理观察与配合是移植手术治疗成功的重要环节。

体外诱导人脐带华通胶间充质干细胞向内皮细胞分化过程中APJ表达变化

目的研究人脐带华通胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly-mesenchymal stem cells,HUW-MSCs)体外诱导向内皮细胞分化过程中表面APJ受体表达的变化,探讨APJ是否可作为鉴定内皮细胞的早期细胞表面标志物。方法剖宫产取脐带后分别用酶消化和组织贴壁法培养获得脐带华通胶间充质干细胞,用酶消化法获得人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)。取2×10~7第2代HUW-MSCs用单克隆APJ-APC荧光抗体标志后行流式分选,测定HUW-MSCs实验前细胞表面表达APJ的水平。实验分3组:诱导组MSCs用含血管内皮细胞生长因子5μg/L、碱性成纤维细胞生长因子10μg/L、表皮生长因子10μg/L和10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)M199培养基培养;共同培养组MSCs先与HUVECs在Transwell 6孔培养板中,用含10%FBS的M199培养5-7 d后转入25 cm^2培养瓶中继续培养,培养液为含10%FBS的M199和培养1 d内皮细胞的M199(2:1)混合培养基:单纯培养组细胞培养基为含10%FBS的M199。培养周期为14 d。分别于第7、10、14天流式检测各组细胞APJ表达水平,同时检测内皮细胞表面APJ水平作为阳性对照。另外于第7、14天检测3个实验组、内皮细胞组、HUW-MSCs组内皮细胞早期标志物CD309表达变化情况,比较各实验组之间APJ与CD309变化趋势。结果HUW-MSCs流式分选出5×10~3APJ^+-HUW-MSCs,表面表达APJ基本呈阴性。诱导组、共同培养组和单纯培养组细胞形态均较HUWMSCs有显著改变,诱导组呈圆形、线性、网状,共同培养、单纯培养组细胞呈卵圆形、长梭形。另外,诱导组生长最快,增殖能力最强;单纯培养组次之;共同培养组细胞生长缓慢,增殖能力最弱。第7、10、14天,3组细胞CD309表达分别为诱导组1.8%、2.6%和8.8%,共培养组0.5%、2.5%和4.7%,单纯培养组0.3%、2.1%和2.7%。第7、10、14天各组APJ阳性表达率分别为诱导组0.5%、0.9%和5.2%,共培养组0.4%、0.8%和3.0%,单纯培养组0.2%、0.6%和2.1%。结论HUW-MSCs表面APJ表达基本呈阴性,HUW-MSCs向内皮细胞诱导分化过程中APJ表达逐渐上调,与内皮细胞早期标志物CD309变化趋势基本一致,可作为早期内皮细胞鉴定的标志物。

人脐带华通胶间充质干细胞的生物学特性及研究新进展

人脐带华通胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cell,h WJMSC)是一类具有自我更新、多向分化潜能的成体干细胞。由于其取自分娩过程中的废弃物——脐带,因此来源广泛、取材方便、不受任何伦理学限制,同时相对其他来源的成体干细胞例如骨髓间充质干细胞,h WJ-MSC免疫原性更弱、增殖能力更强、干细胞性能更加原始,使其成为一种新型的细胞来源,广泛应用于各种疾病模型的细胞移植以及基因治疗。综述新近研究的h WJ-MSC的生物学性状、增殖分化潜能、免疫性能以及其在各类疾病中的应用进展。

Elabela促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:Elabela是近几年发现的新型APJ内源性受体,在成人心血管系统中广泛分布,对心血管疾病也有一定的影响,但是Elabela在干细胞向心肌样细胞诱导分化过程中的作用以及分化过程中对APJ表达量的影响尚未发现相关研究。目的:探讨Elabela对脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响。方法:复苏冻存的脐带华通胶间充质干细胞,当细胞汇合度达到80%-90%时,使用5-氮胞苷使其向心肌样细胞分化,24 h后实验组更换为含Elabela、体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基,对照组更换为含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。诱导第7,14,21,28天,观察细胞形态变化,同时收集各组细胞的总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测心肌特异性标记物Nkx2.5、cTnT、Connexin 43 mRNA及蛋白表达;采用实时荧光定量PCR和流式细胞技术检测诱导后的心肌样细胞中APJ的表达。结果与结论:①在诱导分化各阶段,实验组心肌特异性标记物Nkx2.5、cTnT、Connexin43 mRNA和蛋白表达量均高于对照组,APJ表达量也高于对照组;②结果表明,Elabela在脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中起一定的促进作用;Elabela作为APJ的另一个激动剂在诱导分化过程中可促进APJ的表达。

人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导髓核细胞退变的保护作用

背景:人脐带华通胶间充质干细胞移植到犬退变椎间盘模型中可存活,恢复部分椎间盘高度,但其对炎性损伤后髓核细胞是否有修复治疗作用目前还没有文献报道。目的:观察人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导大鼠髓核细胞退变的保护作用。方法:将第3代SD大鼠髓核细胞分3组培养,对照组用含胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;白细胞介素1β组以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;实验组先以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,再更换完全培养基与人脐带华通胶间充质干细胞非直接共培养24 h。采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪测定3组髓核细胞凋亡率,RT-PCR测定各组髓核细胞基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂1的表达,caspase试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。结果与结论:(1)白细胞介素1β组、实验组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),实验组低于白细胞介素1β组(P<0.05);(2)白细胞介素1β组、实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量高于对照组(P<0.05),基质金属蛋白酶抑制剂1表达量低于对照组(P<0.05);实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量低于白细胞介素1β组,基质金属蛋白酶抑制剂1表达量高于白细胞介素1β组(P<0.05);(3)白细胞介素1β组、实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性高于对照组(P<0.05),实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性低于白细胞介素1β组(P<0.05);(4)结果表明,人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导的髓核细胞退变凋亡有明显的抑制作用。

BK通道抑制剂对人脐带华通胶来源的间充质干细胞的增殖、凋亡及细胞因子的影响

目的探究BK通道抑制剂对人脐带华通胶来源的间充质干细胞(WJ-MSC)的细胞活性、细胞凋亡、细胞因子分泌的影响。方法以组织贴壁法分离培养人WJ-MSC,Western-blot检测BK通道的表达;用不同浓度BK通道抑制剂处理后,CCK-8法检测细胞活性,Annexin-V-FITC/PI检测细胞凋亡,Elisa检测细胞因子(IL6、IL10)的表达。结果人WJ-MSC上存在BK通道的表达,BK通道抑制剂能够明显降低细胞活力(P<0.05);促进细胞凋亡(P<0.05);促进细胞因子(IL6)的分泌(P<0.05),但并不增加IL10的分泌。结论 BK通道抑制剂能够抑制人WJ-MSC的活性,促进细胞凋亡,促进IL6的分泌。

关于"人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定"一文图片勘误

《华中科技大学学报(医学版)》于2012年第41卷第5期第529页发表的"人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定"一文,经作者检查发现文章中脐带干细胞流式鉴定图(图2)与作者在《Biomed Res Int》2013年第438243卷上发表的题为"Side-by-side comparison of the biological characteristics of human umbilical cord and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells"一文中脐带干细胞流式鉴定图(Fig 2. b1及b3 )重复.

比较不同诱导体系体外诱导华通胶间充质干细胞分化为内皮细胞的研究

目的比较诱导因子和非接触共同培养2种方法诱导人脐带华通胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's jelly-mesenchymal stem cells,HUW-MSCs)分化为内皮细胞的优劣。方法剖宫产取脐带用酶消化和组织块贴壁2种方法获得HUW-MSCs。实验分诱导因子组、共同培养组和单纯培养组。诱导因子组用血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合诱导培养;共同培养组HUWMSCs与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)非接触共同培养;单纯培养组只加培养液培养。培养周期为14 d。第7天检测CD309,第10天进行Dil标记乙酰化低密度脂蛋白(Dil-labeled acetylated low density lipoprotein,Dil-Ac-LDL)吞噬实验;第14天检测CD31、血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)和一氧化氮(nitric oxide,NO)。结果各组细胞形态较实验前有显著变化,但均未见典型铺路石样改变。3组细胞表达CD309上调;诱导因子组和单纯培养组表达CD31下降,而共同培养组CD31明显上调。NO及ET-1含量检测均较HUVECs低,但差异无统计学意义(P>0.05),3组之间比较差异同样无统计学意义(P>0.05)。vWF及Dil-Ac-LDL各组反应呈弱阳性。结论 HUW-MSCs在诱导因子和内皮细胞旁分泌作用下均具有向内皮细胞分化倾向,使用诱导因子较非接触共同培养方法诱导HUW-MSCs向内皮分化的效果更好。

脐带间充质干细胞促进蜕膜血管内皮生长因子表达改善自然流产小鼠妊娠结局

背景:早期自然流产与母胎界面血管形成障碍或异常有关,人脐带华通氏胶间充质干细胞具有向损伤部位迁移及促血管生成的作用,目前人脐带华通氏胶间充质干细胞作用于早期自然流产蜕膜基质细胞的研究尚未有报道。目的:探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞对早期自然流产蜕膜基质细胞增殖、凋亡及血管内皮生长因子表达的影响,以及对早期自然流产小鼠妊娠结局的影响。方法:①分离培养早期自然流产和人工流产蜕膜组织,实时荧光定量PCR和Western blot检测蜕膜组织中血管内皮生长因子的表达;②第3代人脐带华通氏胶间充质干细胞和原代自然流产蜕膜基质细胞共培养72 h,EdU、Annexin V-FITC分别检测蜕膜基质细胞增殖和凋亡情况,实时荧光定量PCR和Western blot检测蜕膜基质细胞中血管内皮生长因子的表达;③复制CBA/J×DBA/2自然流产小鼠模型,孕1,3,5 d尾静脉移植人脐带华通氏胶间充质干细胞悬液0.1 mL(细胞浓度为1×1010 L-1),孕14 d计算胚胎吸收率,ELISA检测外周血中血管内皮生长因子水平;实时荧光定量PCR和Western blot检测蜕膜组织中血管内皮生长因子的表达。结果与结论:①与正常蜕膜组织相比,早期自然流产患者蜕膜中血管内皮生长因子表达显著降低;②人脐带华通氏胶间充质干细胞促进早期自然流产蜕膜基质细胞中血管内皮生长因子的表达,促进细胞增殖、抑制细胞凋亡;③人脐带华通氏胶间充质干细胞促进自然流产小鼠蜕膜组织中血管内皮生长因子表达,进而减少胚胎吸收率;④结果表明,合适剂量的人脐带华通氏胶间充质干细胞可以促进蜕膜中血管内皮生长因子表达,改善早期自然流产妊娠结局。

人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力

目的探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力。方法收集健康足月产胎儿脐带组织,采用酶消化法从华通氏胶中分离hUCMSCs,选取第3代对数生长期细胞,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞免疫表型分子的表达,免疫荧光染色检测干细胞标记物及其体外向肌源性细胞的分化,荧光显微镜观察及流式细胞术检测携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染hUCMSCs后GFP的表达。结果采用酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外成功进行扩增培养。hUCMSCs可高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达CD14、CD34、CD45和HLA-Ⅱ;能表达干细胞标记物Oct4和Sox2,且在体外特殊培养条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax7和Myo D;转染的hUCMSCs可稳定表达GFP,转染率高达50%~70%。结论人脐带华通氏胶组织存在间充质干细胞,且其具有向肌源性细胞分化的潜能。

人WJ-MHCs移植对心肌梗死后心力衰竭大鼠TNF-α及NT-proBNP的影响

目的观察人华通胶间充质干细胞(WJ-MHCs)对心肌梗死后心力衰竭大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)及N末端B型脑利钠肽前体(NT-proBNP)的影响。方法采用80只雄性SD大鼠通过异丙肾上腺素多点皮下注射,剂量为200mg/kg,隔24h注射1次共2次。待大鼠存活1周建立模型后各取12只随机均衡分入WJ-MHCs移植组、普通对照组、空白对照组各12只健康大鼠,3组再分为移植前和移植后4周两个亚组。WJ-MHCs移植组于心肌梗死后1周移植以DAPI标记的WJ-MHCs,空白对照组及普通对照组不做处理正常饲养。分别于移植前和移植后4周检测大鼠心脏组织中TNF-α水平,移植后4周WJ-MHCs细胞在大鼠心脏中的情况,大鼠TNF-α和NT-proBNP的水平,左室射血分数(LVEF)。结果移植后WJ-MHCs移植组较移植前LVEF明显提高(P<0.05),较移植前及普通对照组血清TNF-α及NT-proBNP明显降低(P<0.05);移植后WJ-MHCs移植组较普通对照组心脏组织中TNF-α表达明显减少;WJ-MHCs移植组病死率(16.67%)较普通对照组病死率(33.33%)明显降低;免疫荧光显示移植后4周仍可检测到移植的WJ-MHCs。结论移植人WJ-MHCs可明显降低心梗后心衰大鼠心脏组织及循环中的TNF-α,降低循环中的NT-proBNP,提高心功能。

脓毒症大鼠来源的外泌体对WJ-MSC的免疫调控能力的影响

目的探究脓毒症大鼠外周血来源外泌体对人脐带华通胶来源间充质干细胞(WJ-MSC)免疫调控能力的影响。方法采用盲肠穿孔结扎(CLP)方法建立脓毒症大鼠模型,分别提取对照组(假手术组)和实验组(CLP模型组)大鼠外周血的外泌体,鉴定其表面标志物及形态特征,并分别处理WJ-MSC,CCK8检测WJ-MSC的细胞活性,Annexin-VFITC/PI检测凋亡细胞比例,q PCR检测细胞因子(IL-10、TNF-α)的mRNA水平;分别将两组外泌体处理后的WJ-MSC与LPS刺激后的人单核巨噬细胞(THP-1)共培养,q PCR检测THP-1细胞中细胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β)的mRNA水平变化。结果两组外泌体在表面标志物和形态特征上无明显差异;实验组外泌体不影响WJ-MSC的增殖活性,但可抑制其凋亡,同时能够上调IL-10的mRNA表达,下调TNF-α的mRNA表达;经过两组外泌体处理后的WJ-MSC,均能够降低LPS刺激下THP-1细胞中促炎性细胞因子(IL-1β,TNF-α)的表达,两组无明显差异。结论脓毒症大鼠外周血来源的外泌体能够上调WJ-MSC中IL-10的表达,下调TNF-α的表达,可增强其免疫调控能力。

缺血性心脏病干细胞治疗的争论热点与最新进展

文章讨论了细胞修复治疗在缺血性心脏病中的应用。介绍了不同类型细胞的心脏修复效应。重点介绍了胚胎干细胞(ESCs)及诱导型多能干细胞(iPS)临床应用障碍,而ESC及iPS源心脏前体细胞,心肌源性干细胞等修复心肌的最新进展。尤其重点描述了来自于人胚外或胚胎中胚层的脐带华通胶源间充质干细胞的细胞生物学特性,如:兼有胚胎干细胞及间充质干细胞标志特征,无伦理道德问题,多向分化而无致肿瘤性,多代增殖保持干性特征,独特的免疫调节功能等,使之WJ-MSCs将成为心脏再生医学中最具希望的种子细胞。