靶向B7-H3抑制人脐静脉血管内皮细胞生长、迁移和血管形成

目的探讨靶向抑制协同信号分子B7-H3对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)生长、迁移及血管生成能力影响。方法使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减HUVECs B7-H3分子,采用CCK-8实验检测24 h、48 h和72 h细胞增殖;采用Transwell实验检测24 h细胞迁移;三维细胞培养观察细胞血管生成。结果与空序列转染的阴性对照(siRNA-Control)组比较,siRNA-720、siRNA-1707和siRNA-16903条备选siRNA对B7-H3表达的抑制效果不同,siRNA-1690抑制率明显高于siRNA-720和siRNA-1707,因此,选择使用siRNA-1690序列进行后续实验。CCK-8细胞活力实验结果显示,敲减B7-H3后24 h、48 h和72 h HUVECs增殖能力分别下降24%、22%(P>0.05,与24 h比较)和15%(P<0.05,与48 h比较);Transwell迁移实验表明,与siRNA-Control组对比,敲减B7-H3的HUVECs 24 h迁移能力明显减低(P<0.01);三维细胞培养结果表明,采用si-B7-H3敲减B7-H3基因后,HUVECs血管生成能力明显下降(P<0.01)。结论靶向B7-H3抑制HUVECs生长、迁移及血管生成。

雷帕霉素上调人脐静脉内皮细胞自噬活性抑制细胞增殖

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬激活对细胞增殖的影响。方法使用雷帕霉素(Rapa)处理HUVECs,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin 1和unc-51样激酶1(ULK1)的表达,透射电镜(TEM)检测自噬小体,丹酰尸胺染色(MDC)检测自噬荧光;CCK-8法和EdU法检测自噬激活对细胞增殖的影响;血管形成实验检测成管能力。结果Rapa处理后,与对照组相比,LC3、Beclin 1和ULK1表达增强,实验组绿色自噬荧光表达强于对照组,TEM可见自噬小体;CCK-8和EdU结果显示,与对照组相比,实验组细胞自噬活化后细胞增殖能力减弱,成管能力降低。结论在一定时间内,Rapa上调HUVECs自噬活性抑制细胞增殖。

miR-145-5p在原发性高血压患者血清中的表达及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的探究miR-145-5p在原发性高血压(EH)患者血清中的表达及对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响。方法以2019年1月至2022年3月于山西医科大学汾阳学院就诊的160例EH患者及160例同期体检正常者为研究对象,RT-qPCR检测EH患者及同期体检正常者血清中的miR-145-5p表达水平。体外培养HUVEC,将之分为对照组、miR-145-5p mimic组、mimic-NC组、miR-145-5p inhibitor及inhibitor-NC组,CCK-8法检测各组HUVEC增殖情况;AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组HUVEC凋亡情况;Western blot检测各组HUVEC增殖、凋亡相关蛋白[增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)]表达情况。结果miR-145-5p在EH患者血清中的表达水平明显低于体检正常者(P<0.05);与对照组、mimic-NC组比较,miR-145-5p mimic组HUVEC细胞增殖率及PCNA、Cyclin D1蛋白表达均增加,早期凋亡率、晚期凋亡率及Bax、Caspase-3蛋白表达均减少(P<0.05);与对照组、inhibitor-NC组比较,miR-145-5p inhibitor组HUVEC细胞增殖率及PCNA、Cyclin D1蛋白表达均减少(P<0.05),早期凋亡率、晚期凋亡率及Bax、Caspase-3蛋白表达均增加(P<0.05)。结论miR-145-5p在EH患者血清中呈低表达,过表达miR-145-5p可促进HUVEC增殖并抑制其凋亡。

利伐沙班对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的探讨利伐沙班(RIV)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能损伤的影响。方法根据干预措施,将实验分为空白对照组(A组,常规培养液),Ox-LDL组(B组,100μg/mL Ox-LDL的培养液),Ox-LDL+RIV125组(C1组,100μg/mL Ox-LDL和125 ng/mL RIV的培养液),Ox-LDL+RIV250组(C2组,100μg/mL Ox-LDL和250 ng/mL RIV的培养液)和Ox-LDL+RIV500组(C3组,100μg/mL Ox-LDL和500 ng/mLRIV的培养液),各组细胞均处理48 h。采用CCK-8法检测各组细胞存活率的变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,采用免疫印迹(Western blot)法检测细胞核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)蛋白表达水平。结果与B组比较,C1组、C2组、C3组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和uPAR表达水平均显著降低(P<0.05);C3组IL-1β,TNF-α,IL-6水平和p-NF-κB p65表达水平显著降低(P<0.05)。结论RIV能显著恢复细胞活力、减少细胞凋亡和由Ox-LDL引起的炎性反应,可能通过NF-κB和uPAR的调节而发挥作用。

高糖诱导下人脐静脉内皮细胞形态、增殖活性及钙黏蛋白表达变化

目的探讨不同糖浓度状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形态、增殖活性及VE-钙黏蛋白(VE-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达变化。方法将HUVECs分为正常对照组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)、甘露醇组(葡萄糖浓度5.5 mmol/L+甘露醇浓度24.5 mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度分别为11.1、22.2、33.3 mmol/L),分别培养24、48、72 h,以显微镜观察细胞形态,用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Western blotting法检测各组HUVECs VE-cadherin、E-cadherin、N-cadherin表达。结果培养72 h,正常对照组细胞形态呈类圆形,高糖组、甘露醇组细胞形态由圆形、椭圆形逐渐到条索状,细胞数量减少、细胞间隙较前增加。培养24h,高糖组细胞增殖率高于正常对照组;随糖浓度升高,高糖组细胞增殖率呈现先升高后降低趋势。培养48、72h,高糖组细胞增殖率低于正常对照组;随着糖浓度升高,高糖组细胞增殖率逐渐降低。以上各组细胞增殖率比较均有统计学差异(P均<0.05)。培养24、72 h,与正常对照组比较,高糖组HUVECsN-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin蛋白表达明显升高(P均<0.05);且随着葡萄糖浓度升高,高糖组细胞N-cadherin、VE-cadherin、E-caderin蛋白表达呈现先升高后降低的趋势。结论在高糖条件下,HUVECs发生形态转变,增殖率下降,且伴有细胞钙黏蛋白N-cadherin、VE-cadherin、E-cadherin表达变化。

甘草苷调节丙酮酸激酶M2改善过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞功能障碍

目的:探讨甘草苷(LIQ)调节丙酮酸激酶M2(PKM2)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能障碍的影响。方法:使用H_(2)O_(2)诱导HUVECs损伤模型,将细胞分为对照组(常规培养的HUVECs)、H_(2)O_(2)组(400μmol/L H_(2)O_(2)诱导的HUVECs模型)、H_(2)O_(2)+LIQ组(400μmol/L H_(2)O_(2)+1μmol/L LIQ)、H_(2)O_(2)+LIQ+紫草素(PKM2抑制剂)组(400μmol/L H_(2)O_(2)+1μmol/L LIQ+1μmol/L紫草素)。使用qRT-PCR检测PKM2 mRNA水平,荧光探针检测活性氧(ROS)水平,Western Blotting检测Nrf2、HO-1、PKM2、p-PKM2、Bcl-2、Bax及TNF-α、IL-1β蛋白表达变化。结果:与H_(2)O_(2)组相比,LIQ干预显著上调PKM2 mRNA水平、PKM2及p-PKM2的蛋白水平,抑制了ROS水平及TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,Bcl-2/Bax比例显著增加。与H_(2)O_(2)+LIQ组相比,使用紫草素显著逆转了上述指标变化趋势(P<0.01)。结论:LIQ可上调PKM2表达,改善H_(2)O_(2)诱导的HUVECs细胞功能障碍。

基于人脐静脉内皮细胞的OGD/R模型研究当归-川芎药对中7个活性成分对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路的影响

目的探讨当归-川芎药对中7个活性成分(绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、丁烯基苯酞、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯)对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白及其上下游血管活性物质、黏附因子和炎症因子的调控作用。方法构建人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,采用细胞增殖试剂盒(CCK-8法)检测细胞活力,探索7个成分的最佳造模时间;通过检测乳酸脱氢酶(LDH)释放探索最佳给药浓度;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测7个成分对VEGF、VCAM-1、PAI-1、NF-κB、IL-1和IL-6表达的影响;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测7个成分对VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白mRNA表达的影响。结果HUVEC氧糖剥夺6 h再复氧为最佳造模时间。高剂量绿原酸组、阿魏酸组、洋川芎内酯H组,低、中剂量丁烯基苯酞组,中、高剂量洋川芎内酯A、藁本内酯组显著降低LDH漏出率(P<0.05,P<0.01);绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯H部分剂量组细胞中VEGF、ICAM-1、VCAM-1的表达显著降低,绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯H、藁本内酯部分剂量组细胞NF-κB的表达显著下降,绿原酸、咖啡酸、丁烯基苯酞、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A部分剂量组细胞中IL-6的表达显著增加,绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯A部分剂量组细胞IL-1表达显著减少,阿魏酸、洋川芎内酯H部分剂量组细胞中PAI-1的表达量显著下降(P<0.05,P<0.01);绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、丁烯基苯酞和洋川芎内酯A部分剂量组细胞中ERK、VEGF、NF-κB、VEGFR2和MMP9的mRNA相对表达量显著下调,洋川芎内酯H和洋川芎内酯A部分剂量组细胞中AKT的mRNA相对表达量均显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论当归-川芎中的药效成分可能通过抑制黏附因子、炎症因子和VEGF-PI3K-AKT/NF-κB信号通路关键蛋白mRNA的表达,从而发挥抗缺血性中风的作用。

环状RNA hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

背景:同型半胱氨酸水平上升会诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡,但机制尚不清楚。目的:探讨hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡中的作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,将其分为对照组、同型半胱氨酸组、干扰对照组、干扰对照+同型半胱氨酸组、干扰hsa-circ-0001360组、干扰hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组、过表达对照组、过表达对照+同型半胱氨酸组、过表达hsa-circ-0001360组和过表达hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组,同型半胱氨酸的干预浓度均为100μmol/L。干预细胞72 h后,应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-circ-0001360的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Bax的表达明显升高(P<0.01),Bcl-2的表达明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增高(P<0.01);②与对照组相比,同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中hsa-circ-0001360的表达明显升高(P<0.01);③hsa-circ-0001360在人脐静脉内皮细胞的细胞质中表达显著高于细胞核(P<0.01);④与干扰对照组或干扰对照+同型半胱氨酸组相比,干扰hsa-circ-0001360组和干扰hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3、Bax的表达明显降低(P<0.01),Bcl-2的表达明显升高(P<0.01),细胞凋亡率明显降低(P<0.01);⑤与过表达对照组或过表达对照+同型半胱氨酸组相比,过表达hsa-circ-0001360组和过表达hsa-circ-0001360+同型半胱氨酸组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3、Bax的表达明显升高(P<0.01),Bcl-2的表达明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01);⑥以上结果表明,hsa-circ-0001360可以促进同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡。

丹参酮ⅡA磺酸钠对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞(hUVECs)功能的影响,并阐明其作用机制。方法:将hUVECs进行传代培养并分为空白对照组、尿毒症毒素刺激组、尿毒症毒素+STS组和尿毒症毒素+STS+细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂组,其中后2组中STS的浓度为10 mg·L^(-1);先给予各组剪切力刺激,剪切力大小为12 dyn·cm^(-2);采用CCK-8法测定各组细胞增殖活性,Western blotting法检测各组细胞中ERK、核因子κB(NF-κB)和Ⅰ型胶原蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达情况;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)法检测各组细胞凋亡率。结果:CCK-8法检测,在剪切力作用后,尿毒症毒素刺激组和尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞增殖活性低于尿毒症毒素+STS组(P<0.01)。Western blotting法检测,与尿毒症毒素组比较,尿毒症毒素+STS组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原蛋白表达水平升高(P<0.01);抑制ERK信号通路后,与空白对照组、尿毒症毒素组和尿毒症毒素+STS组比较,尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。RT-qPCR法检测,与尿毒症毒素组比较,尿毒症毒素+STS组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达水平升高(P<0.01);抑制ERK通路后,与空白对照组、尿毒症毒素组和尿毒症毒素+STS组比较,尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。TUNEL法检测,尿毒症毒素+STS组的细胞凋亡率小于尿毒症毒素刺激组和尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组(P<0.05)。结论:一定浓度STS能通过ERK信号通路调节NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA及蛋白表达来改善尿毒症毒素作用下的内皮细胞增殖,减少细胞凋亡。

山药总蛋白对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激的保护作用及机制研究

探究山药总蛋白对高浓度D-葡萄糖(High concentrations of D-glucose,HG)诱导的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激损伤的保护作用及其机制。利用50 mmol/L HG建立HUVECs损伤模型。将HUVECs随机分为对照组、模型组、山药总蛋白低剂量组(0.5 mg/mL)以及山药总蛋白高剂量组(1 mg/mL),评估山药总蛋白对HG处理的HUVECs的细胞活力、细胞形态及血管生成能力的影响;检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活力;以及培养基上清液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)、8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的水平;测定B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Txnip)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶剪切体-1(Cleaved caspase-1)和IL-1β蛋白的表达水平。结果显示,山药总蛋白能显著提高HG处理后的HUVECs的细胞活力(P<0.01),改善细胞凋亡形态,并显著升高SOD和CAT的活力(P<0.05或P<0.01)以及凋亡相关蛋白(Bcl-2/Bax)的比值、血管形成能力、NO分泌量。此外,山药总蛋白还显著降低了HUVECs的ROS、MDA、8-OHdG、IL-1β和IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)及炎症相关蛋白(Txnip、NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β)的表达水平(P<0.05或P<0.01),并且上述指标的变化均呈现明显的浓度依赖性。本研究结果表明,山药总蛋白可能通过抑制Txnip/NLRP3信号通路从而保护HUVECs拮抗HG诱导的氧化应激,恢复HUVECs内的氧化平衡,进一步减轻细胞的炎症反应。

参元丹干预氧化三甲胺诱导人脐静脉内皮细胞损伤的机制研究

目的:探讨参元丹对氧化三甲胺(TMAO)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的干预作用及机制。方法:建立TMAO诱导的HUVEC细胞损伤模型,将HUVEC分为正常对照组、模型组(300μmol/L TMAO)、参元丹低剂量组(300μmol/L TMAO+25μg/mL参元丹)、参元丹中剂量组(300μmol/L TMAO+50μg/mL参元丹)、参元丹高剂量组(300μmol/L TMAO+100μg/mL参元丹)。分别检测各组细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-1β含量。结果:TMAO可诱导HUVEC发生氧化应激反应及炎症反应,参元丹可降低TMAO损伤细胞内ROS、MDA水平(P<0.05),同时抑制IL-1β的表达水平(P<0.05)。结论:参元丹可能通过抑制氧化应激反应及炎症反应,减轻TMAO诱导的内皮细胞损伤。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯致人脐静脉内皮细胞氧化损伤及白藜芦醇的修复作用

目的:探究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的氧化损伤,以及白藜芦醇对该损伤的修复作用。方法:通过CCK8实验筛选DEHP的损伤浓度和白藜芦醇的修复浓度;化学分光光度比色法检测HUVEC丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)的不同表达情况;活性氧荧光探针检测不同处理组HUVEC内活性氧水平;JC-1试剂盒检测不同组HUVEC线粒体膜电位;CCK8实验、Transwell实验、划痕愈合实验观察HUVEC增殖、迁移能力;细胞流式实验、蛋白质印迹实验观察HUVEC的凋亡情况和凋亡相关蛋白的表达。结果:80μmol/L DEHP作用HUVEC 24 h后,细胞增殖能力明显降低(P<0.01),40μmol/L白藜芦醇对细胞无明显毒性;损伤组细胞的丙二醛水平和SOD活性较对照组均明显上升(P均<0.01),修复组丙二醛水平和SOD活性较损伤组均明显下降(P均<0.05);损伤组细胞的活性氧表达较对照组明显上升(P<0.01),修复组较损伤组明显下降(P<0.01);损伤组细胞的线粒体膜电位较对照组明显下降(P<0.01),修复组较损伤组明显上升(P<0.01);损伤组细胞的增殖、迁移、成管能力较对照组明显下降(P均<0.05),修复组较损伤组明显上升(P均<0.05);损伤组细胞的凋亡水平较对照组明显上升(P<0.05),修复组较损伤组明显下降(P<0.05)。结论:DEHP能够通过氧化应激途径抑制HUVEC的增殖、迁移和成管能力,并诱导其凋亡,而白藜芦醇可以有效修复该种损伤。

普萘洛尔对人脐静脉内皮细胞生物学行为及SOX18、MMP-7、VEGFA表达的影响

目的探讨普萘洛尔对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖、凋亡、迁移及成管能力,以及对性别决定区Y框18(sex determining region Y-box 18,SOX18)、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表达的影响。方法以不同浓度的普萘洛尔处理HUVEC,采用CCK-8法检测细胞活力,选出最佳浓度及时间。实验分为对照组,普萘洛尔不同浓度(50、100、150μmol/L)组,采用流式细胞术、细胞划痕实验和成管实验观察HUVEC凋亡、迁移和管腔形成情况,Western blot和实时荧光定量PCR法检测SOX18、MMP-7、VEGFA蛋白及mRNA表达水平。结果与对照组相比,普萘洛尔不同浓度组细胞凋亡率升高(P<0.05),且随药物浓度增加显著升高(P<0.05);普萘洛尔不同浓度组伤口愈合率降低,成管节点数和成管总长度减少,SOX18、MMP-7、VEGFA蛋白及mRNA表达下调(P<0.05)。结论普萘洛尔可抑制HUVEC的增殖、迁移、成管能力并促进细胞凋亡,降低SOX18、MMP-7和VEGFA表达水平。

越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的影响及机制研究

目的研究越婢汤对阿霉素诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)高通透性的影响,探讨其治疗肾病综合征水肿的可能作用机制。方法将HUVEC分为对照组、模型组和越婢汤低、中、高剂量组(200、300、400μg/mL),CCK-8法检测细胞活力,Transwell法检测细胞通透性,Western blot检测凋亡信号调节激酶1(ASK1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)、p38蛋白表达,免疫荧光法检测ZO-1和VE-cadherin表达。结果与对照组比较,模型组HUVEC细胞活力明显降低,细胞通透性明显增加,细胞肿胀、膜结构破坏,ASK1、p-p38蛋白表达明显升高,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,越婢汤各剂量组细胞活力明显增加,细胞通透性明显降低,ASK1、p-p38蛋白表达明显降低,ZO-1、VE-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论越婢汤可改善阿霉素诱导的HUVEC高通透性,其作用机制可能与抑制ASK1/p38信号通路、上调细胞连接蛋白表达相关。

幽门螺杆菌感染所致人脐静脉内皮细胞功能异常及炎性反应的作用机制研究

目的探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)通过激活转录激活因子3(STAT3)/核转录因子κB(NF-κB)通路对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖、迁移、凋亡及炎性反应的影响。方法将HUVEC分为对照组(未感染Hp)和Hp感染组(Hp感染复数=25),通过倒置显微镜观察感染Hp的HUVEC形态变化;细胞计数试剂盒8细胞增殖实验和平板克隆实验检测2组HUVEC增殖能力,Transwell实验和划痕愈合实验检测HUVEC的迁移能力,流式细胞术检测HUVEC的凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应检测2组HUVEC中Hp细胞毒素相关基因A、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)信使核糖核酸表达情况;Western blot检测HUVEC细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、原癌基因(C-Myc)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、STAT3/NF-κB信号通路蛋白表达情况。结果与对照组比较,Hp组细胞增殖、纵向、横向迁移能力明显降低,CyclinD1、PCNA、C-Myc、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达量降低,Bax、磷酸化STAT3/STAT3、磷酸化NF-κB P65/NF-κB-P65蛋白表达量和HUVEC凋亡率升高(P<0.05,P<0.01),炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-αmRNA水平升高(2.71±0.05 vs 1.06±0.41,1.42±0.02 vs 0.92±0.11,2.50±0.29 vs 1.00±0.10,5.34±0.57 vs 1.00±0.16,P<0.01)。结论Hp通过激活STAT3/NF-κB通路抑制HUVEC增殖、迁移,并诱导其凋亡和炎性反应的发生。

流体剪应力对人脐静脉内皮细胞葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白表达的影响

目的探索流体剪应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法以HUVECs作为实验细胞,设计并构建流体动力学模拟实验系统,控制流体动力学模拟实验系统中灌流液的流速,以实现对实验细胞施加不同的流体剪应力。按实验细胞在实验系统中所承受的不同流体剪应力,将实验细胞分为低剪应力组(A组;0.4 Pa)、中剪应力组(B组;0.8 Pa)和高剪应力组(C组;1.2 Pa)。每组HUVECs包含3个细胞玻片,每个玻片经实验系统灌流液反复循环流经12 h。采用蛋白质印迹法对各组细胞中GRP78和CHOP蛋白水平进行检测,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术测定各组细胞GRP78和CHOP蛋白及其信使RNA(mRNA)相对水平。应用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析。结果(1)A、B、C组HUVECs中GRP78蛋白相对表达水平分别为1.33±0.46、0.93±0.34、0.64±0.30;多组间比较差异有统计学意义(F=36.17,P<0.05)。A组GRP78蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0013)。3组HUVECs中CHOP蛋白相对表达水平分别为:A组1.29±0.38,B组0.90±0.34,C组0.59±0.29;多组间比较差异有统计学意义(F=41.27,P<0.05)。A组CHOP蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0004)。(2)A、B、C组HUVECs中GRP78 mRNA相对表达水平分别为18.3±3.4、11.3±1.8、5.4±2.2;多组间比较差异有统计学意义(F=189.20,P<0.05)。A组GRP78 mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78 mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。3组HUVECs中CHOP mRNA相对表达水平分别为:A组20.4±3.8,B组14.2±2.1,C组7.8±1.3;多组间比较差异有统计学意义(F=171.80,P<0.05)。A组CHOP mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。结论低流体剪应力可能增加HUVECs中GRP78、CHOP的蛋白及其mRNA表达水平。

恩格列净通过转录因子EB调控溶酶体自噬改善人原代脐静脉内皮细胞损伤

目的:探究恩格列净(EMPA)改善人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)内皮损伤的机制。方法:用TNFα对HUVECs进行刺激,分为5组:①对照组:PBS处理;②TNFα组:TNFα刺激;③EMPA组:TNFα+EMPA;④BAF组:巴夫洛霉素A1(BafA1)+TNFα+EMPA;⑤siTFEB组:细胞造模前预干扰转录因子EB(TFEB),余同EMPA组。造模24h后收集细胞。分别进行Westernblot检测血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、细胞间黏附分子(ICAM)、血管细胞黏附分子(VCAM)、溶酶体相关膜糖蛋白1(LAMP1)、P62、LC3、TFEB、pTFEB等蛋白的表达情况;细胞免疫荧光检测血管内皮VE-cadherin、LAMP1、TFEB等指标;单核细胞黏附、细胞渗漏、RNA测序检测、腺病毒转染GFP-LC3检测细胞内的LC3堆积量;慢病毒转染RFP-GFP-LC3检测细胞内的自噬流。结果:Westernblot结果显示,TNFα组较对照组的P62、LC3、pTFEB表达水平升高(P<0.01),LAMP1、TFEB下降(P<0.01);EMPA组较TNFα组P62、LC3、pTFEB表达水平下降(P<0.05),LAMP1、TFEB升高(P<0.05);BAF组较EMPA组的P62、LC3表达量升高(P<0.01);干扰TFEB后,siTFEB组较EMPA组的P62、LC3、表达量升高(P<0.01),LAMP1下降(P<0.01),免疫荧光结果显示TNFα组较对照组的TFEB在胞质堆积增加(P<0.01),EMPA组较TNFα组TFEB在胞质堆积减少(P<0.01),RNA测结果提示EMPA激活自噬通路;RFP-GFP-LC3双荧光结果显示EMPA组较TNFα组自噬溶酶体形成增多(P<0.01)。结论:EMPA通过TFEB增强溶酶体自噬,改善HUVECs内皮损伤。

miR-486促人脐静脉内皮细胞内皮间质转化的机制研究

目的 探讨微小RNA-486(miR-486)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内皮间质转化(End MT)的影响及其调控机制。方法 常规培养HUVECs,并转染miR-486模拟物(mimic)及阴性对照(NC)质粒,实时荧光定量PCR测定miR-486表达;Western blot检测血管内皮细胞钙黏蛋白(VE Cadherin)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、纤连蛋白(FN)表达;免疫荧光染色检测细胞中CD31与α-SMA表达;Western blot检测磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路相关蛋白表达。使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002与miR-486 mimic共作用于HUVECs,Western blot检测VE Cadherin、CollagenⅢ、CD31、α-SMA、FSP1、FN、PTEN及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。通过生物信息学在线软件预测miR-486与PTEN的靶向结合位点,构建PTEN 3'UTR野生型(WT)及突变型(MUT)质粒载体,双荧光素酶报告基因实验检测miR-486对PTEN的靶向作用。结果 与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中miR-486表达升高(P<0.05),VE Cadherin、CD31表达降低(P<0.05),CollagenⅢ、α-SMA、FN表达升高(P<0.05),FSP1表达未发生变化(P>0.05)。免疫荧光结果显示,与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中CD31表达明显减弱(P<0.05),α-SMA表达明显增强(P<0.05);与Control组和miR-486 NC组比较,miR-486 mimic组HUVECs中PTEN蛋白表达显著降低(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05)。与miR-486 mimic组比较,miR-486 mimic+LY294002组PTEN蛋白表达显著升高(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。与miR-486 mimic组比较,miR-486mimic+LY294002组VE Cadherin、CD31表达显著升高(P<0.05),且CollagenⅢ、α-SMA、FN表达显著降低(P<0.05),FSP1表达未发生变化(P>0.05)。双荧光素酶报告基因分析结果显示,与转染miR-486 NC比较,转染miR-486 mimic能够有效抑制含PTEN原序列的PTEN WT 3'UTR的荧光素酶活性(P<0.05),而对敲除了结合位点的PTEN MUT 3'UTR则无明显抑制作用(P>0.05)。结论miR-486通过抑制PTEN表达促进HUVECs的End MT进程,该机制与激活PI3K/AKT信号通路有关。

马脐静脉内皮细胞分离培养及其功能验证

【目的】建立一种简便且高效的体外马脐静脉内皮细胞(equine umbilical vein endothelial cells,eUVECs)分离和培养方法,并提供一个可靠的细胞模型,用于研究马的血管生成功能。【方法】在无菌条件下,从马脐带中分离静脉,并用PBS液彻底冲洗。使用0.2%Ⅰ型胶原酶对脐静脉进行消化25~30 min后,收集分离的eUVECs进行培养。每12 h使用倒置显微镜观察eUVECs的生长状况。使用CCK-8法测定第1代(P1)和P3代eUVECs在7 d内的D450 nm值,并绘制生长曲线。通过免疫荧光染色方法鉴定内皮细胞标记物CD31和CD34的表达情况。使用间充质干细胞成脂和成骨分化诱导试剂诱导eUVECs,以验证其是否具有分化特性。确定内皮细胞后,添加梯度上升浓度(5、10、15、20、25 ng/mL)的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激eUVECs,使用CCK-8法检测细胞活性,观察细胞形态变化。使用Matrigel法培养eUVECs,用ImageJ软件分析数据,并统计新生血管的4个指标:成管交叉点、成管长度、成管数和成管面积。寻找体外血管生成能力的最佳TNF-α刺激浓度。【结果】使用0.2%Ⅰ型胶原酶消化法分离的eUVECs 4~5 d内的汇合度达到90%。在倒置显微镜下观察,这些细胞生长良好并呈铺路石状排列。通过免疫荧光染色确认了CD31和CD34在eUVECs中的阳性表达;并且eUVECs表现出薄弱的成脂和成骨分化能力。在Matrigel法培养条件下,20 ng/mL TNF-α处理组的成管交叉点数、成管长度、成管数和成管面积等血管形成能力指标最高,且极显著高于对照组(P<0.01)。然而,在常规培养条件下,随着TNF-α浓度增加到15 ng/mL,eUVECs的增殖受到显著抑制甚至开始导致细胞的凋亡。【结论】Ⅰ型胶原酶脐带注满消化法能够成功分离培养出原代eUVECs,20 ng/mL TNF-α显著增强eUVECs体外血管生成能力,eUVECs可以作为体外研究血管生成的细胞模型。

KIF2C对肝细胞癌细胞恶性生物学行为和人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的:探究驱动蛋白-13家族2C(KIF2C)对肝细胞癌(HCC)细胞增殖、侵袭和迁移以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成的影响,为HCC治疗提供潜在靶点。方法:用数据库数据分析KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中的表达及其与血管生成相关因子(VEGFR2和HIF-1α)表达的相关性,常规培养人正常肝细胞QSG-7701、HUVEC和HCC细胞Huh-7、Hep3B2.1-7,用Lipofectamine 3000转染试剂将sh-NC和sh-KIF2C转染至Huh-7、Hep3B2.1-7细胞,qPCR检测各组QSG-7701、Huh-7和Hep3B2.1-7细胞中KIF2C mRNA的表达,WB法检测各组细胞中KIF2C蛋白的表达,细胞克隆形成实验检测敲低KIF2C对Hep3B2.1-7和Huh-7细胞克隆形成的影响,小管生成实验检测敲低KIF2C表达的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的条件培养液对HUVEC血管生成能力的影响。结果:数据库分析结果显示,KIF2C mRNA和蛋白在HCC组织中均呈高表达(均P<0.01),用qPCR和WB法检测人HCC中KIF2C mRNA和蛋白的表达水平,结果显示其mRNA和蛋白在各HCC细胞中也呈高表达(均P<0.01),与数据库数据分析结果相符。数据库数据分析还显示,KIF2C与HCC组织中VEGFR2、HIF-1α的表达水平呈正相关(P<0.05或P<0.01)。成功构建了稳定低表达KIF2C的Huh-7和Hep3B2.1-7细胞(均P<0.01),敲低KIF2C表达均可明显抑制Huh-7和Hep3B2.1-7细胞的增殖能力(均P<0.01)、侵袭和迁移能力(均P<0.01),敲低KIF2C表达的HCC细胞条件培养液均可显著抑制体外HUVEC的血管生成能力(P<0.05或P<0.01)。结论:KIF2C可促进Huh-7和Hep3B2.1-7细胞增殖、侵袭和迁移以及HUVEC血管生成的能力,提示KIF2C可能是治疗HCC的潜在靶点。