干细胞脑内移植有效标记研究:绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

目的:观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的效果,以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后,GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法:首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA,然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育,使GFP质粒转入胚胎干细胞;筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内,移植21d后,观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果:GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP,细胞打散计数证实大约60%的细胞携带GFP,移植21d后,大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论:脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞,携带有GFP的ES移植后21d,GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。

人神经干细胞的分离、克隆和动物脑内移植及转基因表达

目的 分离和克隆人神经干细胞，并在体外和体内分析其生物学特征。方法 我们联合采用四步法从人胚胎前脑分离制备多潜能神经干细胞，并使用重组腺病毒相关病毒载体（ｒＡＡＶ）将ＬａｃＺ基因和胶质细胞起源的神经营养因子（ＧＤＮＦ）基因转移到神经干细胞。结果 二株人神经干细胞被成功建立。这些克隆化后的神经干细胞在细胞培养中和移植到新生小鼠脑内后能发育分化成神经元、少枝胶质细胞和星形胶质细胞。在ｒＡＡＶ转导基因后，神经干细胞可在体外和体内表达转基因产物。结论 这种具有转基因表达能力的神经干细胞为神经系统疾病的进一步治疗研究提供了有潜在价值的细胞资源。

转基因细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型的实验研究

以６－羟多巴胺单侧损毁大鼠中脑多巴胺能系统，建立帕金森病动物模型，通过检测给予阿普吗啡后大鼠的旋转圈数，判断多巴胺的减少或恢复程度。向脑内植入能表达酪氨酸羟化酶的遗传工程改造细胞，以改善大鼠模型的运动失常和纹状体多巴胺水平。将带有酪氨酸羟化酶基因的重组载体ｐＣＭＶＴＨ在体外通过脂质体转染技术转入成肌细胞和肌管细胞内，再将这些经遗传改造、表达酪氨酸羟化酶的细胞植入纹状体。结果显示，这些表达酪氨酸羟化酶的肌细胞可在大鼠模型体内长期存活，并使模型大鼠的异常运动明显改善及使纹状体内多巴胺水平升高，显示此种方法有很重要的临床实用性。

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。

微囊化PC12细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究

目的 观察微囊化 PC12细胞脑内移植对帕金森病 (PD)大鼠模型的治疗作用。方法 以 6 - OHDA分两点注入大鼠纹状体制备 PD模型。应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠 -壳聚糖 -海藻酸钠 (ACA )微囊包裹PC12细胞 ,分别将微囊化 PC12细胞、裸 PC12细胞、空微囊移植入 PD模型鼠损伤侧纹状体内 ,以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异。行纹状体和黑质的 HE染色和酪氨酸羟化酶免疫组化染色观察其病理形态学的变化。对移植的微囊化 PC12细胞回收后再培养 ,以 MTT和台盼兰检测细胞活性。结果 微囊化 PC12细胞移植能够改善PD模型鼠的旋转行为 ,与移植前和空微囊移植组相比有显著差异 (P<0 .0 5 ) ,症状改善至少持续 3个月。裸 PC12细胞移植组大鼠的旋转行为也有改善 ,与移植前相比有统计学差异 (P<0 .0 5 ) ,但仅持续了 2个月 ,移植 8周后又渐回到移植前水平 ,且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成。空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异 (P>0 .0 5 )。回收微胶囊内的 PC12细胞再培养生长良好 ,MTT法和台盼兰法检测显示细胞具有生物活性。结论 微囊化 PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的 PD模型鼠的旋转症状 ,ACA新型微包囊能够起到有效的免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用。

人脐血间充质干细胞脑内移植改善帕金森病大鼠行为缺陷的研究(英文)

背景:已有较多的研究证明脐血细胞能向神经元样细胞分化,且成功的运用脐血治疗脑卒中及其他神经系统疾病的研究已有报道,能否应用脐血干细胞治疗神经变性疾病尚未可知。目的:探讨应用人脐血间充质干细胞治疗大鼠帕金森病的可行性及其机制。设计:随机对照实验研究。地点和对象:健康Sprague-Dawley大鼠18只,清洁级,体质量220～260g。脐血标本取自郑州大学第三附属医院妇产科,每个标本60～120mL。干预:制备6-羟多巴胺帕金森病偏侧大鼠模型,随机分为3组:①对照组(n=6)。②PBS组(n=6):在每只大鼠右侧纹状体移植10μL的PBS。③间充质干细胞组(n=6):将3×106个用BrdU标记的脐血间充质干细胞植入大鼠右侧纹状体,4周后用阿朴吗啡诱发旋转试验并用免疫组织化学检测植入细胞的存活情况及纹状体酪氨酸羟化酶阳性细胞。主要观察指标:①移植前后各组大鼠旋转圈数。②免疫组织化学染色结果。结果:脐血间充质干细胞在体内存活,与对照组相比,间充质干细胞移植组阿朴吗啡诱发的旋转行为犤每30钟大鼠旋转圈数为212±60比340±30犦显著改善(P<0.05),但右侧纹状体酪氨酸羟化酶阳性细胞数与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论:人脐血间充质干细胞脑内移植能改善帕金森大鼠的行为缺陷,可作为治疗神经变性疾病的一种潜在细胞?

立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能

背景:细胞替代治疗是重建受损神经系统组织结构,恢复神经系统功能的一种有效策略,具有极为广阔的应用前景。目的:探讨立体定向脑内移植神经干细胞对颅脑损伤大鼠神经运动功能的影响。方法:将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组,每组10只,应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型,伤后1 d研究组大鼠脑实质内移植胚胎神经干细胞,对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。在脑损伤前1 d、伤后1 d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能。移植后2周,取脑组织分别行苏木精-伊红染色、抗BrdU、胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶免疫组化染色。结果与结论:伤后1,2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P<0.05)。研究组大鼠受损脑组织中有较多的Brd U阳性神经干细胞,一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶阳性表达,对照组大鼠受损脑组织中未见有Brd U阳性细胞。实验结果表明,立体定向脑内移植神经干细胞可以在颅脑损伤灶中增殖分化,进而显著改善大鼠的神经运动功能。

人胚胎嗅鞘细胞脑内移植治疗脑卒中后疼痛1例

目的：探讨人胚胎嗅鞘细胞脑内移植对脑卒中后中枢性疼痛的有效性。方法：取4个月中期流产胚胎的嗅球，孕妇及其家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准，消化成单个嗅鞘细胞后，培养2周。供、受体细胞HLA配型后行人胚胎嗅鞘细胞脑内移植。1例72岁男性患者因“右侧肢体感觉、运动障碍伴疼痛8年”入院。入院后诊断：①脑出血后遗症。②原发性高血压。于入院后第4天在局麻下采用人胚胎嗅鞘细胞脑内移植，细胞植入到脑出血侧放射冠处，注射细胞数约1×10^10L^-1。移植前后2～4周分别采用临床神经功能评定量表、Barthel Index评定量表评价患者神经功能。临床神经功能缺损评定标准：轻型：0～15分，中型：16～30分，重型：31—45分；Barthel Index评定量表评定标准：60分以上提示被检查者生活基本可以自理，41-60分者生活需要帮助，20—40分者生活需要很大帮助，20分以下者生活完全需要帮助，Barthel指数40分以上者康复治疗的效益最大。结果：嗅鞘细胞移植后患者无发热、血小板变化等血液相容性不良反应及其他并发症。术后第1天，患者自诉右侧肢体疼痛较以前减轻70％，肌张力较以前有所减轻，右手活动较以前灵活。腰部肌力较以前增加。术后第2天，右侧肢体疼痛较以前减轻80％，右手及脚趾活动较以前灵活。术后第5天，右侧肢体疼痛较以前减轻90％，肌张力继续降低。术后3周患者病情平稳出院。临床神经功能缺损评分总分由12分增至14分；Barthel Index评分前后无变化为85分。结论：人胚胎嗅鞘细胞脑内移植对卒中后疼痛近期效果理想，长期效果有待随访。

神经干细胞立体定向脑内移植治疗大鼠重型颅脑损伤

目的探讨神经干细胞立体定向脑内移植对颅脑损伤大鼠的治疗效果。方法采用Feeney等人的方法制成大鼠脑损伤模型,伤后24h将体外培养的胚胎神经干细胞经立体定向移植到脑损伤灶内。伤前24h、伤后24h及伤后1、2周行动物神经学缺损评分。结果移植后1和2周,接受神经干细胞移植的大鼠神经学缺损评分明显低于对照组(P<0.05);且其脑组织切片中的神经元数量较对照组明显增多(P<0.01)。结论经立体定向移植到脑内损伤灶的神经干细胞可存活、增殖、分化、并可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能。

肾上腺髓质脑内移植后帕金森病鼠纹状体内单胺类神经递质的变化

采用高压液相色谱──电化学检测法测定纹状体内单胺类递质多巴胺及其代谢产物３，４－二羟基苯乙酸、去甲肾上腺素，以研究肾上腺髓质脑内移植后帕金森病（ＰＤ）鼠纹状体内部分神经生化改变。结果发现肾上腺髓质脑内移植可以基本矫正ＰＤ鼠异常旋转行为、弥补单胺类神经递质缺乏。研究结果提示肾上腺髓质脑内移植后可能与宿主神经组织形成神经再支配，肾上腺髓质脑内移植是治疗ＰＤ的较有效的手段。

TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病模型动物的旋转行为及神经生化的影响(英文)

背景:神经干细胞(neuronalstemcells,NSCs)能提供多巴胺能神经元来治疗帕金森病(Parkinsondisease,PD),但脑内移植NSCs治疗PD的疗效目前观察结果欠佳。研究显示酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)基因脑内移植能缓解PD的症状,TH基因修饰的NSCs脑内移植可能使PD的治疗效果出现新的结局。目的:探讨TH基因修饰的NSCs脑内移植对PD模型动物旋转行为和神经生化的影响。设计:完全随机对照实验。地点和对象:本实验选择105只大鼠,在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。干预:构建pN2ATH反转录病毒载体质粒,用PA317细胞包装,G418筛选阳性克隆,病毒上清感染NSCs,将NSCs和表达TH的NSCs植入PD大鼠纹状体内,测定移植后不同时间PD大鼠旋转行为改善以及多巴胺和3,4-二羟基苯乙酸(dihydroxy-phenylaceticacid,DOPAC)含量变化。主要观察指标:PD大鼠旋转行为改善以及多巴胺和DOPAC含量变化。结果:TH基因修饰的NSCs移植8周后能显著降低PD大鼠旋转行为,增加纹状体多巴胺和DOPAC含量,疗效好于单纯NSCs移植组和对照组。结论:TH基因修饰的NSCs脑内移植能增加纹状体多巴胺和DOPAC含量,降低PD大鼠旋转行为,从而对PD大鼠有明显的治疗作用。

大鼠胚胎神经上皮细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究

目的 观察大鼠胚胎神经上皮细胞植入帕金森病大鼠纹状体后的存活、分化情况及治疗作用。 方法 孕 11d大鼠剖腹取胚胎 ,剥离神经管 ,胰酶消化后获取神经管壁上的神经上皮细胞 ,在脑立体定位仪下植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内 ,于移植后不同时间诱发旋转实验 ,观察症状的改善 ,并灌注取脑 ,切片后做酪氨酸羟化酶 (TH)免疫组织化学染色 ,检测胚胎神经上皮细胞的存活及分化状况。 结果 胚胎神经上皮细胞脑内移植后 ,帕金森病鼠的旋转行为有明显改善。移植后 2、4及 8周时可检测到成片或散在的TH 免疫阳性细胞。 结论胚胎神经上皮细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后 ,可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。

几丁质多孔体联合培养大鼠胎脑神经细胞脑内移植的实验研究

目的 评价几丁质 (Chitin ,C)的生物相容性 ,研究几丁质与大鼠胎脑神经细胞 (FBN)复合体 (C FBN)脑内移植对脑损伤的修复作用。方法 将体外联合培养 3～ 5天的C FBN移植到大鼠大脑皮质损伤部位 ,术后 3、6、1 0、1 5及 30天光镜、免疫细胞化学、透射电镜观察。结果 几丁质对FBN生长无不良影响 ,脑组织对移植物无明显的免疫排斥反应 ,载体内有大量存活神经细胞 ,术后各时段都检出BrdU阳性细胞 ,移植区可见突触形成。结论 几丁质具有良好的组织相容性 ,移植的FBN在脑内可以继续生长、成熟并建立突触联系。

神经干细胞脑内移植后的存活、迁移和分化

从胚胎或成体大鼠脑组织、人胚脑组织均能分离到神经干细胞 ,将它们进行体外原代培养扩增或永生化后植入脑内 ,均能观察到其在脑内的迁移和分化现象。其分化能力主要取决于移植部位的脑内微环境 ,但这种影响作用是相对的。同时 ,体外培养环境如培养时间和细胞融合程度、维甲酸类诱导分化剂处理、NGF转导处理再移植或与嗜铬细胞 (分泌NGF)共移植等 ,也能决定神经干细胞脑内移植后向神经元方向分化的能力。神经干细胞移植为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。

神经干细胞脑内移植治疗中枢神经损伤21例临床观察

近年来的研究发现,神经干细胞移植到病损或者受伤的脑组织中,能产生新的神经细胞,促进脑的再生修复.国内外医学学术界都公认神经干细胞移植是修复神经功能受损的有效方法.

脑内移植的机理探讨及基因修饰细胞在脑内移植中的应用

脑内移植从１８９０年至今虽有百年的历史，但成功的脑内移植仅是近十余年的事。理想的脑内移植是移植入宿主脑内的胚脑神经元能与宿主神经元重建突触环路并相互整合，移植存活的细胞在宿主脑内发挥生物学微泵的作用。随着分子生物学的发展，神经科学家们利用基因工程技术，将已知疾病所缺乏的基因，通过转染的方法将所需基因转染入供体细胞，再移植入宿主脑内，以替供失去的神经元。目前研究工作还刚兴起，但可能预测，在未来的世纪中，基因修饰细胞脑内移植将成为治疗神经系失常疾病的新手段，新措施。

40例立体定向下自体骨髓干细胞脑内移植治疗帕金森病患者的围手术期护理

目的探讨立体定向下自体骨髓干细胞脑内移植治疗帕金森病患者的围手术期护理策略。方法对40例立体定向下自体骨髓干细胞脑内移植治疗帕金森病的患者加强术前检查、心理护理,术后并发症的预防、护理及心理护理。结果患者均获得良好疗效,随访3～6个月,无一例复发。结论自体骨髓干细胞脑内移植治疗帕金森病需术前积极做好术前准备,并针对术后可能出现的并发症予以预防和精心护理,可使患者取得较好的预后。

脑内移植治疗帕金森病的移植神经元凋亡时程的研究

为了探讨将 E14腹侧中脑 ( VM)细胞悬液植入 Parkinson病大鼠纹状体后的移植神经元的凋亡时程及其数量的变化规律 ,将实验动物分为移植组和空白对照组 ,两组均包括移植后 1、4、7和 2 8d四个时间点。分别运用 TU NEL 法、TH免疫组化法、H-E染色及透射电镜观察了凋亡细胞的生化和形态特征 ,藉以估计其凋亡细胞的数量变化状况。结果表明 ,移植组中用 TU NEL法观察移植神经元具有 TU NEL 阳性反应胞核的细胞在移植后 1、4、7、2 8d所占的百分比分别为 0 .14 9%、0 .13 1%、0 .0 66%和0 .0 0 5 % ,移植后 1、4d与 7、2 8d之间的比较差异显著 ( P<0 .0 0 1)。 TH免疫组化反应显示 ,在移植后 1、4、7、2 8d TH免疫反应阳性细胞存活率分别为 15 .7%、6.3 %、5 .9%和 4.9% ,移植后 1d与 4、7、2 8d之间的比较差异显著 ( P<0 .0 0 1)。本研究结果提示 :( 1)移植的胚 VM细胞凋亡主要见于移植后的头 7d,这一期间内大约有 90 %移植神经元发生凋亡 ;( 2 )这种凋亡对移植的TH细胞存活率的影响仅见于移植后的 4d。

转基因星形胶质细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠的研究

目的 评价酪氨酸羟化酶 (TH)基因转染的星形胶质细胞移植入帕金森病 (PD)模型大鼠脑内后对旋转行为改善作用。方法 用pcDNA3 1/TH质粒转染原代培养的星形胶质细胞 ,采用免疫组化及RT PCR方法检测到TH表达后 ,将转基因的星形胶质细胞移植入PD模型大鼠脑纹状体内 ,观察PD大鼠的旋转行为变化情况。结果 移植后共观察 12周 ,转基因细胞移植组PD大鼠 (n =10 )的旋转行为明显改善 (P <0 0 5 ) ,改善情况在 2～ 8周最显著 ,对照组大鼠 (n =10 )的旋转行为无变化。结论 转基因的星形胶质细胞脑内移植后可短期改善PD大鼠的旋转行为 ,星形胶质细胞有可能作为有效的载体细胞。

脑内移植重组基因治疗帕金森病的实验研究

本研究把Ⅰ型人酪氨酸羟化酶（ｈｕｍａｎｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｔｙｐｅⅠ；ＨＴＨ１）ｃＤＮＡ连接到逆转录病毒载体ＬＮＳＸ上，构建成真核表达载体ＬＮＳＨＴＨ１，然后通过ｉｎｖｉｖｏ途径转染帕金森病模型鼠的纹状体细胞。外源的ＨＴＨ１基因在宿主脑内得到了表达，并使其病理行为改善约７０％。这种新的基因治疗帕金森病的方式，有其独特的优越性。