弓形虫脑组织包囊两种分离法的比较

弓形虫脑组织包囊两种分离法的比较张爱民，陆琴，杨惠珍弓形虫的慢性感染会使其在脑、肌肉等组织内形成包囊。随着研究的深入开展，对弓形虫包囊期的分子生物学、免疫学的研究及其与致病的关系成为当前研究的热门课题。因此，需要高纯度的包囊作为研究材料，这使得分离纯...

刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本m^(6)A甲基化修饰的影响

目的分析刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本的N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰水平的影响。方法20只雌性C57BL/6J小鼠随机分为TgCtwh6感染组(7只)、LHG感染组(7只)和对照组(TgCtwh6感染组、LHG感染组的对照各3只)。TgCtwh6感染组、LHG感染组分别灌胃接种中国Ⅰ型wh6株(TgCtwh6)和中国Ⅲ型LHG株刚地弓形虫感染小鼠脑组织悬液0.2ml(20个包囊/鼠),对照组灌胃等量的生理盐水。分别在接种后15、30和45 d,用抽签法随机抽取感染组小鼠各1只,麻醉后处死,取脑组织,于显微镜下分别记录大脑皮层区、海马区和嗅球区的包囊数。感染后45 d每组分别取3只小鼠的全脑组织,提取总RNA,制备基因组文库,进行转录组测序,筛选差异甲基化位点(DML),统计感染组和对照组的mRNA的差异m6A甲基化位点及其所在转录本;对甲基化位点所在转录本进行基因本体功能注释(GO)分析,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,对甲基化差异转录本进行基因集富集分析(GSEA)。选取甲基转移酶样3(METTL3)、肥胖相关蛋白(FTO)和YTH结构域3(YTHDF3)等3种m6A甲基化修饰蛋白基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测其相对转录水平。结果感染组小鼠均感染成功。感染后45 d,大脑皮层、海马和嗅球的包囊数分别为(5676±10)、(4773±9)、(243±10)个。感染组和对照组共检出760650个甲基化位点,其中GGACA、GGACC、GGACT、ACGAT等4种m6A模体的甲基化水平分别占16.8%(127923/760650)、4.6%(35164/760650)、3.8%(28983/760650)和0.4%(3122/760650);共检出高甲基化位点所在转录本127016条,其中GGACA、GGACC、GGACT和ACGAT所在的转录本分别为71727、27754、24556和2979条。感染组与对照组小鼠脑组织转录组中ACGAT、GGACA、GGACC、GGACT等4种m6A模体的DML位点总数为9233,其中高甲基化位点4832个,低甲基化位点4851个。GO分析结果显示,DML所在转录本显著富集于生物过程中的细胞过程、细胞组分中的细胞和分子功能中的结合等功能。DML所在转录本的KEGG富集分析结果显示,分子间相互作用网络主要富集在溶酶体、剪接体和多巴胺能突触信号通路等途径中。对生物过程的GO富集分析结果显示,DML所在的转录本中,生物过程相关的部分转录本主要富集于蛋白糖基化、神经元凋亡负调控、蛋白质的入核转运等过程。GSEA分析结果显示,对照组和两个感染组的组间差异甲基化高分富集于成纤维细胞增殖负调控通路和Hippo信号通路相关的转录本子集中,其中筛选出ENSMUST00000105393、ENSMUST00000006523、ENSMUST00000055261和ENSMUST00000038658等4个关键转录本,分别编码共刺激因子配体(ICOSL)、富含半胱氨酸肠蛋白1(CRIP1)、MOB激酶激活剂1A201(MOB1A201)和MOB1A202,与对照组相比,TgCtwh6感染组、LHG感染组的这4个基因表达均上调。qRT-PCR结果显示,TgCtwh6感染组、LHG感染组小鼠脑组织mettl3 mRNA相对表达水平分别为5.47±1.09、1.63±0.06,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=4.05、5.03,均P<0.05);ythdf3 mRNA相对表达水平分别为3.57±0.08、1.80±0.25,与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=18.95、2.85,均P<0.05);fto mRNA相对表达水平分别为0.41±0.04、0.60±0.12,与对照组(1.00±0.06)比较差异有统计学意义(t=7.67、2.99,均P<0.05);qRT-PCR结果与转录组测序获得的转录趋势一致。结论弓形虫慢性感染可导致小鼠脑组织转录本m6A甲基化修饰水平升高,并可能通过对icosl、crip1和mob1a等关键差异转录本的修饰调控,造成宿主脑组织内与精神行为相关的生物学进程和信号通路的改变。

中国Ⅲ型弓形虫潜伏性感染前后宿主脑转录组差异分析

目的分析中国III型弓形虫虫株感染小鼠脑组织前后转录组表达差异,鉴定与小鼠行为变化相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。方法取感染和未感染中国III型弓形虫LHG株的小鼠脑组织,镜下观察脑包囊;提取总RNA,构建转录组文库,采用Oxford Nanopore Technologies单分子实时测序平台对感染组和对照组文库进行第三代纳米孔高通量测序,以Fold Change≥1.5且P<0.05作为筛选标准,从测序结果中筛选DEGs并对其进行Gene Ontology(GO)富集分析,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析和Protein-Protein interaction network(PPI network)蛋白互作网络分析。结果共检测到722个DEGs,其中708个表达上调,14个表达下调。GO功能注释表明DEGs主要富集在宿主的突触刺激应答和免疫应答过程,同时也与行为调控、成瘾、化学突触传递等生物学过程有关。KEGG富集分析表明,多数DEGs富集在寄生虫和病毒感染相关通路。将基因表达差异幅度大、GO注释和KEGG富集排名均靠前的DEGs取交集,共筛选到10个关键上调基因(Cd74、Ccl5及H2家族的H2-Aa、H2-Ab1、H2-Eb1、H2-D1、H2-Q7、H2-K1、H2-DMb1、H2-Qa基因)和5个关键下调基因(Gng4、Frzb、Hes5、Mfge8、Cartpt基因)。对关键DEGs进行PPI互作分析,H2蛋白家族及CD74的蛋白互作连接度大,节点多。结论MHC类分子可能是弓形虫LHG株感染小鼠过程中宿主抵抗其感染的主要因子,弱毒弓形虫株可能通过干扰宿主的神经元干细胞功能和兴奋性神经递质代谢通路导致宿主出现精神行为异常。

刚地弓形虫诱导宿主精神行为障碍的研究进展

刚地弓形虫可引起人兽共患寄生虫病,弓形虫组织包囊引起的慢性感染可导致宿主神经系统功能异常,诱发宿主行为改变或精神障碍,如导致寄生动物宿主降低对捕食者的恐惧等,人类宿主的多种精神障碍也与慢性感染显著相关。目前已知介导该过程可能的机制,包括脑包囊感染、中枢神经递质失衡,以及表观遗传调控“行为操纵”等,但确切机制尚不明确。本文就刚地弓形虫感染导致宿主精神行为异常的相关研究,以及目前研究较为深入的发生机制研究进展进行综述。

Case Report:Congenital spinal intradural arachnoid cyst associated with intrathoracic meningocele in a child

Congenital spinal intradural arachnoid cyst associated with intrathoracic meningocele is very rare.We report a case in a 9-year-old Chinese boy who presented with a two-week history of progressive paraparesis and gait ataxia.Magnetic resonance imaging revealed that a dorsal intradural extramedullary cystic lesion extended from T1 to T5 and compressed the spinal cord.A left lateral intrathoracic meningocele pouch was found incidentally at the level of T1.The arachnoid cyst as well as meningocele was removed and the spinal cord compression was relieved.Arachnoid cyst was confirmed by histological examination.The patient recovered well postoperatively.This is the second report of such a case in the world according to the available literature.The take-home message for our case is that the surgical approach should be individualized,depending on the size and location.