吴茱萸碱调节HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路对脑梗死大鼠神经炎症的影响

目的:探讨吴茱萸碱调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对脑梗死大鼠神经炎症的影响。方法:采用大脑中动脉栓塞法构建脑梗死大鼠模型,随机分为模型组、吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组、吴茱萸碱高剂量+空载质粒组、吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组,每组15只,另选取15只健康大鼠设为假手术组,以吴茱萸碱和质粒分组处理后,采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评估大鼠神经损伤;三苯基氯化四氮唑(TTC)染色检测大鼠脑梗死面积;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检测大鼠海马神经元凋亡率;透射电镜观察大鼠海马神经元超微结构;酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清及脑组织促炎因子环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-18(IL-18)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平;蛋白免疫印迹法检测大鼠脑组织HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠海马神经元超微结构发生损伤,mNSS评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡率、血清与脑组织COX-2、IL-18、iNOS水平、脑组织HMGB1、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65明显升高(P<0.05);与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组、吴茱萸碱高剂量+空载质粒组大鼠海马神经元超微结构损伤均减轻,mNSS评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡率、血清与脑组织COX-2、IL-18、iNOS水平、脑组织HMGB1、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低(P<0.05);吴茱萸碱高剂量组大鼠海马神经元超微结构损伤较吴茱萸碱低剂量组进一步减轻,mNSS评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡率、血清与脑组织COX-2、IL-18、iNOS水平、脑组织HMGB1、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65进一步降低(P<0.05)。与吴茱萸碱高剂量组比较,吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠海马神经元超微结构损伤加重,mNSS评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡率、血清与脑组织COX-2、IL-18、iNOS水平、脑组织HMGB1、TLR4蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05)。结论:吴茱萸碱可通过阻止HMGB1/TLR4/NF-κB信号激活而降低促炎因子表达,从而抑制神经炎症,减轻脑梗死大鼠神经功能损伤。

BMAL1减轻H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤机制研究

目的探讨脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(BMAL1)通过核因子E2相关因子2(NRF2)调节活性氧(ROS)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的心肌细胞损伤的影响。方法体外培养H9c2细胞和BMAL1稳定过表达的H9c2细胞,建立H_(2)O_(2)诱导的H9c2细胞损伤模型,并将细胞分为对照(Control)组、H_(2)O_(2)组、BMAL1过表达(BMAL1-OE)组、BMAL1过表达+H_(2)O_(2)(BMAL1-OE+H_(2)O_(2))组、BMAL1过表达+NRF2抑制剂(BMAL1-OE+ML385)组、BMAL1过表达+NRF2抑制剂+H_(2)O_(2)(BMAL1-OE+ML385+H_(2)O_(2))组。采用CCK-8法检测细胞活力,荧光探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯检测ROS生成,Western blot检测BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表达,酶联免疫吸附试验法检测白细胞介素(IL)-1β释放。结果与Control组相比,H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力减弱,ROS生成增多,BMAL1和NRF2蛋白表达水平降低,NLRP3蛋白表达水平升高,IL-1β释放增多(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,BMAL1-OE+H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力升高,ROS生成减少,BMAL1和NRF2蛋白表达水平升高,NLRP3蛋白表达水平降低,IL-1β释放减少(P<0.05)。与BMAL1-OE+H_(2)O_(2)组相比,BMAL1-OE+ML385+H_(2)O_(2)组H9c2心肌细胞活力减弱,ROS生成增多,NLRP3蛋白表达水平升高,IL-1β释放增多(P<0.05)。结论BMAL1可减轻H_(2)O_(2)诱导的H9c2心肌细胞损伤,其机制可能与NRF2调节ROS/NLRP3炎症小体通路有关。

基于HIF-1α/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄芪百合颗粒对高原低氧模型大鼠急性脑损伤的保护作用

目的:观察黄芪百合颗粒对高原低氧模型大鼠缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路的影响。方法:60只SPF级SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(5 mg·kg^(-1))、黄芪百合颗粒高、中、低剂量组(4.1、2.05、1.025 g·kg^(-1))。其中各中药组连续灌胃给药14 d,1次/d,连续3 d腹腔注射地塞米松作为阳性药物组;第15天将模型组、地塞米松组、黄芪百合颗粒高、中、低剂量组至动物低压模拟舱中模拟高海拔低压低氧环境进行暴露,持续暴露3 d,腹主动脉采血并分离血清,处死后摘取脑组织;苏木素-伊红(HE)染色法观察脑组织病理变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠HIF-1α、NLRP3、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、NF-κB、消皮素D(GSDMD)和胱天蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白的表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠HIF-1α、NLRP3、NF-κB p65、GSDMD和Caspase-1 mRNA的表达水平。结果:HE结果显示,与正常组比较,模型组大鼠脑组织病理切片可见锥体细胞排列松散且分布紊乱,大小不一;与模型组比较,地塞米松组及黄芪百合颗粒高、中剂量组锥体细胞病理改变减轻。ELISA结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,地塞米松组及黄芪百合颗粒高、中剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠脑组织中HIF-1α、NLRP3、p-NF-κB p65、GSDMD、Caspase-1蛋白相对表达水平均显著升高(P<0.01);与模型组比较,地塞米松组及黄芪百合颗粒高剂量组大鼠脑组织中HIF-1α、NLRP3、p-NF-κB p65、GSDMD、Caspase-1蛋白相对表达均明显降低(P<0.05,P<0.01),黄芪百合颗粒中剂量组大鼠脑组织中HIF-1α、NLRP3、p-NF-κB p65、Caspase-1蛋白相对表达均显著降低(P<0.01),黄芪百合颗粒低剂量组大鼠脑组织中HIF-1α蛋白相对表达降低(P<0.05)。Real-time PCR分析显示,与正常组比较,模型组大鼠脑组织HIF-1α、NLRP3、NF-κB p65、GSDMD和Caspase-1mRNA表达水平显著增加(P<0.01);与模型组比较,地塞米松组大鼠脑组织中HIF-1α、NLRP3、NF-κBp65、GSDMD和Caspase-1mRNA表达水平显著降低(P<0.01);黄芪百合颗粒高剂量组大鼠脑组织中HIF-1α、NF-κBp65、GSDMD和Caspase-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.01);黄芪百合颗粒中剂量组大鼠脑组织中HIF-1α、NLRP3和Caspase-1 mRNA表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芪百合颗粒对低压低氧大鼠急性脑损伤的保护作用可能与HIF-1α/NF-κB/NLRP3信号通路相关。

黄芪建中汤靶向BMAL1调控cAMP/PKA/CREB信号通路对3T3-L1细胞脂解及棕色化模型影响的研究

目的探索黄芪建中汤含药血清对异丙肾上腺素(ISO)诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化模型的抑制作用及与脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白-1(BMAL1)调控环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(CREB)信号通路的关系。方法制备空白及黄芪建中汤含药血清。体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导其分化成熟后分为对照组、空白组、2.5%含药血清组、5%含药血清组、10%含药血清组。除对照组外,其余各组加入10 mmol/L ISO以构建脂肪细胞过度脂解及棕色化模型。采用油红O染色法和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比及其水解后产物的含量,采用实时荧光PCR法和蛋白质印迹法检测各组脂肪细胞脂解及棕色化相关基因及蛋白的表达,以筛选出最优体积分数的含药血清进行下一步慢病毒转染实验。取分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,分别加入BMAL1小干扰RNA、空载体小干扰RNA,构建沉默BMAL1的3T3-L1脂肪细胞。将细胞分为空载体组、含药血清空载体组、BMAL1沉默组和含药血清BMAL1沉默组。各组加入ISO孵育后,油红O染色法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比;ELISA法检测各组脂肪细胞内甘油三酯(TG)、cAMP及培养基中游离脂肪酸(FFA)的含量;蛋白质印迹法检测PKA、CREB的蛋白表达;实时荧光PCR法检测激素敏感性脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、线粒体解偶联蛋白1(UCP1)和T-box转录因子1(TBX1)的mRNA表达。结果与2.5%及5%含药血清组比较,10%含药血清组细胞内cAMP含量及培养基中FFA含量降低(均P<0.05)、TG含量升高(P<0.05)、PKA蛋白表达降低(P<0.05)、HSL及ATGL mRNA表达降低(均P<0.05)。慢病毒转染3T3-L1脂肪细胞后,与空载体组比较,BMAL1沉默组中BMAL1蛋白表达降低(P<0.05),表明BMAL1沉默的脂肪细胞成功构建。与空载体组比较,BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量降低(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量和PKA、CREB蛋白表达升高(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1和TBX1 mRNA表达量升高(均P<0.05)。与BMAL1沉默组比较,含药血清BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量升高(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量、PKA和CREB蛋白表达降低(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1及TBX1的mRNA表达降低(均P<0.05)。结论黄芪建中汤含药血清可以抑制ISO诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化,其机制可能通过介导BMAL1调控cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

古方半夏秫米汤对正常小鼠最大给药量及其对失眠模型大鼠作用的实验研究

目的:观察半夏秫米汤对失眠模型大鼠的治疗作用及其对生物钟基因和神经递质的影响,初步探究其药效物质基础及安全性,阐释临床使用大剂量半夏秫米汤治疗失眠的理论基础,有利于指导临床合理及安全用药。方法:测定半夏秫米汤最大给药量并利用广泛靶向代谢组技术确定其化学成分;采用氯苯丙氨酸(PCPA)诱导大鼠失眠模型,观察半夏秫米汤对失眠模型大鼠的治疗作用及下丘脑组织病理学变化的影响;采用ELISA法检测大鼠下丘脑组织5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、褪黑色素(MT)含量;Western blot法及qRT-PCR法检测大鼠下丘脑组织昼夜运动输出周期(Clock)、脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白1(BMAL1)蛋白及mRNA的表达。结果:半夏秫米汤小鼠最大给药量为810 g/kg。鉴定出999种半夏秫米汤代谢物,主要代谢物为氨基酸及其衍生物类(49.81%)、核苷酸及其衍生物类(16.62%)。与正常对照组相比,模型对照组大鼠体质量增加较少,睡眠潜伏期明显延长,睡眠持续时间显著缩短(P<0.01);同时神经元染色变深,细胞大小不一,形状变长,核皱缩;下丘脑5-HT、MT的含量明显降低,DA含量明显升高,Clock、BMAL1表达明显上调(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,半夏秫米汤8.1、16.2、32.4 g/kg组大鼠体质量增加较大,睡眠潜伏期缩短和睡眠持续时间明显延长(P<0.05或P<0.01),神经元损伤改善;半夏秫米汤16.2、32.4 g/kg组MT的含量明显升高,而DA的含量明显降低(P<0.05或P<0.01);半夏秫米汤32.4 g/kg组5-HT的含量显著升高(P<0.01);半夏秫米汤8.1、16.2、32.4 g/kg组Clock、BMAL1蛋白及mRNA表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论:半夏秫米汤安全范围较大,其代谢产生的氨基酸类和核苷酸类代谢产物可能是其药理作用的重要物质基础。半夏秫米汤具有较好的抗失眠作用,该作用可能与其降低大鼠下丘脑组织中DA含量,增加5-HT、MT含量,抑制下丘脑ClOCK、BMAL1表达有关。

节律基因Bmal1对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响及其机制

目的通过体外细胞实验,从分子水平探讨脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1(Bmal1)基因对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响及其机制。方法体外培养结直肠癌细胞,运用RNA干扰技术转染Bmal1 siRNA,构建Bmal1基因敲除的结直肠癌细胞株。将体外培养的细胞分为对照组、Bmal1基因敲除组(敲除组)、放疗组、Bmal1基因敲除联合放疗组(联合组)。CCK-8检测各组结直肠癌细胞的增殖能力。RT-qPCR检测各组细胞Bmal1、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达水平。Western blot检测各组细胞Bmal1、HIF-1α和VEGF的表达水平。结果CCK-8检测结果显示,细胞增殖能力由强到弱依次为:对照组、敲除组、放疗组、联合组,各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR检测结果显示,联合组细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达水平在4组细胞中均为最低,分别为对照组的0.40倍和0.38倍,其次为放疗组、敲除组,对照组HIF-1α和VEGF mRNA表达水平最高,各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,HIF-1α和VEGF在联合组细胞中表达水平最低,分别为对照组的0.45倍和0.35倍,其次为放疗组、敲除组,对照组HIF-1α和VEGF蛋白的表达水平最高,各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论敲除节律基因Bmal1可以增加结直肠癌细胞对放疗的敏感性,其机制可能与调节HIF-1α/VEGF信号通路有关。