常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OGD3h/R3h损伤细胞)、BIRC5干预组(细胞预先转染腺病毒-BIRC5质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MTT法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用RT-PCR和免疫印迹法分别检测各组细胞BIRC5和VEGF mRNA及蛋白表达。结果正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;BIRC5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达BIRC5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组和阴性对照组的BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组细胞BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达BIRC5基因对OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调VEGF表达有关,提示BIRC5调控VEGF表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。

天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨天麻素(Gas)、薯蓣皂苷元(Dio)及其组合物(GDC)对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用和对脑微血管新生的影响及其作用机制。方法将BMECs分为5组:正常对照组,模型对照组,Gas组(1、2、4、8、16、32μmol·L^(-1)),Dio组(0.25、0.5、1、2、4、8μmol·L^(-1)),GDC组(Gas和Dio浓度分别为1和0.25、2和0.5、4和1、8和2、16和4、32和8μmol·L^(-1))。分组给药12 h后,对模型对照组、Gas组、Dio组和GDC组通过氧糖剥夺法建立BMECs缺氧模型。检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、白细胞介素1β(IL-1β)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度;观察Hoechst 33258、FITC-Annexin V/PI染色,采用Transwell小室实验、细胞划痕实验和小管形成实验,考察Gas、Dio及GDC对缺氧损伤BMECs的保护作用及促进血管新生作用。进一步利用网络药理学和分子对接方法研究GDC抗脑缺血的作用机制。结果Gas、Dio以2、0.5μmol·L^(-1)组合时,可显著提高缺氧损伤BMECs细胞活力(P<0.05),促进细胞增殖;与模型对照组比较,Gas组LDH漏出率降低(P<0.05);Gas组、Dio组与GDC组IL-1β含量均显著下降(均P<0.05),Gas组、GDC组SOD活力升高(P<0.05),Gas组、Dio组以及GDC组凋亡小体减少。GDC可促进BMECs缺氧模型的增殖、侵袭、迁移以及小管形成,表明其在细胞水平上一定程度促进血管新生。网络药理学研究发现,Gas与半胱天冬酶3(CASP3)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、凝血因子Ⅱ(F2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)1蛋白具有良好的结合活性,Dio与内皮一氧化氮合成酶(NOS3)、KDR蛋白具有良好的结合活性,Gas、Dio可能主要通过血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路以及缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路调控脑缺血后血管新生。结论Gas、Dio及GDC具有抗缺氧损伤作用并可促进缺氧损伤后血管新生,作用机制可能与其作用于Akt1、NOS3、VEGFR2等蛋白,调控VEGF/Akt/MAPK等信号通路促进血管新生有关。

丹酚酸A调控LncRNA TSPOAP1-AS1缓解H_(2)O_(2)诱导脑微血管内皮细胞凋亡及血管新生能力的影响

目的 探讨丹酚酸A调控lncRNA TSPAOP1-AS1缓解H2O2诱导脑微血管内皮细胞凋亡及血管新生能力的影响。方法 选取2021年1月-2023年3月在我院收治的80例高血压脑出血患者和健康体检者,分别设为研究组和对照组。将对数生长的HBMECs分为9组,即Control组、H_(2)O_(2)组、SAA-L组、SAA-M组、SAA-H组、si-TSPOAP1-AS1组、si-NC组和pcDNA-TSPOAP1-AS1组。RT-PCR法检测患者血清及细胞中TSPOAP1-AS1的相对表达水平;分别采用CCK-8法、流式细胞仪和Matrigel体外成管试验检测细胞存活率、凋亡率及血管生成能力;ELISA检测细胞氧化应激;蛋白质印迹法检测细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 与对照组(1.00±0.09)相比,研究组患者血清中TSPOAP1-AS1相对表达量(4.36±0.37)明显升高(P<0.01)。与Control组比较,H2O2组细胞中TSPOAP1-AS1相对表达水平(2.65±0.23)、细胞凋亡率(18.29±1.65)、细胞中MDA含量(40.81±3.72)和Caspase-3蛋白(0.78±0.08)、Bax蛋白(0.82±0.09)表达均明显增加,细胞存活率(35.36±3.65)、小管形成数目(85.32±7.68)、细胞中SOD活性(15.48±1.63)、GSH-Px含量(9.43±0.82)及Bcl-2蛋白(0.21±0.02)表达均明显降低(P<0.01);与H2O2组相比,SAA-H组和si-TSPOAP1-AS1组细胞中TSPOAP1-AS1相对表达水平(1.21±0.12)(1.30±0.13)、细胞凋亡率(5.31±0.50)(6.01±0.62)、细胞中MDA含量(8.95±0.82)(9.39±0.92)和Caspase-3蛋白(0.32±0.04)(0.35±0.04)、Bax蛋白(0.40±0.05)(0.45±0.05)表达均明显降低,细胞存活率(87.21±7.64)(82.31±7.50)、小管形成数目(198.75±18.32)(180.31±17.64)、细胞中SOD活性(60.27±5.89)(55.26±5.24)、GSH-Px含量(40.63±4.17)(38.76±3.27)及Bcl-2蛋白(0.70±0.08)(0.68±0.07)表达均明显升高(P<0.01)。与SAA-H组相比,pcDNA-TSPOAP1-AS1组细胞中TSPOAP1-AS1相对表达水平(2.49±0.20)、细胞凋亡率(16.90±1.60)、细胞中MDA含量(39.01±3.83)和Caspase-3蛋白(0.72±0.08)、Bax蛋白表(0.78±0.08)达均明显增加,细胞存活率(40.47±2.89)、小管形成数目(90.15±8.62)、细胞中SOD活性(20.16±2.11)、GSH-Px含量(11.56±1.08)及Bcl-2蛋白(0.28±0.03)表达均明显降低(P<0.01)。结论 丹酚酸A可促进H2O2诱导的HBMECs存活和血管生成,抑制细胞凋亡,减轻氧化应激反应,其作用机制可能和抑制lncRNA TSPOAP1-AS1相关。

HECTD1调控PI3K/AKT信号通路对低氧诱导的脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨低氧应激下HECT结构域E3泛素连接酶1(HECTD1)对脑微血管内皮细胞(BMECs)的影响及其功能机制。方法BMECs细胞在1%O_(2)的条件下培养以诱导低氧刺激。使用多种细胞生物学功能实验测定来评估BMECs中低氧诱导的损伤。乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的检测以评估低氧诱导的氧化应激水平。Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果在常氧条件下,过表达HECTD1可以提高BMECs的细胞活力。在低氧条件下,过表达HECTD1显著减轻了低氧诱导的细胞活力抑制作用。此外过表达HECTD1降低了低氧诱导的BMECs细胞凋亡和氧化应激。结论HECTD1通过阻断PI3K/AKT信号通路来保护BMECs免受低氧应激诱导的损伤,这表明HECTD1在低氧相关的脑疾病中具有治疗价值。

miRNA-589-5p调控氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞损伤的机制

目的 微小核糖核酸-589-5p(miRNA-589-5p)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)3对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(HBMEC)损伤的影响,并探索其潜在的作用机制。方法 HBMEC细胞分为对照组、氧糖剥夺组;运用脂质体法将氧糖剥夺+miRNA-con组(转染miRNA-con)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p组(转染miRNA-589-5p的模拟物序列)、氧糖剥夺+miRNA-si-con组(转染miRNA-si-con)、氧糖剥夺+si-HDAC3组(转染si-HDAC3)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA组(共转染miRNA-589-5p的模拟物序列和pcDNA)、氧糖剥夺+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3组(共转染miRNA-589-5p mimics和pcDNA-HDAC3)转染至HBMEC,并行氧糖剥夺处理;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western印迹检测细胞中miRNA-589-5p、HDAC3 mRNA表达和HDAC3、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2、核因子2相关因子(NRF)2、血红素氧合酶(HO)-1蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH);膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)试剂盒检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光活性。结果 与对照组相比,氧糖剥夺组细胞miRNA-589-5p表达水平明显降低,HDAC3表达、LDH、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达、NRF2/HO-1信号通路关键基因NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表达均显著降低(P<0.05);过表达miRNA-589-5p或沉默HDAC3均可明显抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞上述指标的调控。双荧光素酶报告实验显示,miRNA-589-5p明显抑制野生型HDAC3细胞的荧光活性,并负向调控HDAC3的蛋白表达。过表达HDAC3部分逆转过表达miRNA-589-5p对氧糖剥夺诱导HBMEC细胞的LDH、凋亡的抑制和NRF2/HO-1信号通路的激活作用。结论 miRNA-589-5p抑制氧糖剥夺对HBMEC细胞的损伤,其作用机制与靶向HDAC3,激活NRF2/HO-1信号通路有关。

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

分析大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定。方法 选取大鼠进行取脑,并对其开展原代培养,通过形态学观察、CD31免疫荧光染色对培养、鉴定的细胞实施检测,以获取检测结果。结果 在对细胞进行培养后,以脑微血管段为中心,放射性向周围移动,渐渐形成“铺路石”样,CD31免疫荧光染色鉴定结果显示,细胞质呈棕红色荧光,DAPI衬染的细胞核呈蓝色荧光,阳性细胞率较高。结论 该方法能够成功分离及培养大鼠脑微血管内皮细胞,对研究脑微血管内皮细胞的生物学特性以及功能具有重要作用。

脑络欣通促进氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠的脑微血管内皮细胞血管新生:基于激活caspase-1/Gasdermin D/通路

目的探讨脑络欣通(NLXTD)含药血清对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)焦亡及血管新生的影响和可能作用机制。方法BMECs体外培养,分别经OGD/R诱导、NLXTD含药血清处理及siRNA转染caspase-1,设置Control组:BMECs+10%空白血清;OGD/R组:BMECs+OGD/R+10%空白血清;NLXTD组:BMECs+OGD/R+10%NLXTD含药血清;siRNA-NC组:BMECs转染siRNA-NC+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1+NLXTD组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%NLXTD含药血清。采用CCK-8法、Transwell小室实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移、成管能力;试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA法检测培养液中炎性因子IL-1β、IL-18的含量;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D及血管生成关键蛋白VEGF,VEGFR2的表达。结果BMECs经OGD/R诱导后出现明显的损伤;与OGD/R组比较,10%的NLXTD含药血清能显著提高OGD/R损伤BMECs的存活率、迁移能力及成管能力(P<0.01),降低IL-1β、IL-18的含量以及LDH的释放(P<0.01);Western blot实验结果显示,NLXTD含药血清可上调OGD/R损伤BMECs的VEGF和VEGFR2蛋白表达(P<0.01),并降低pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D的蛋白表达(P<0.01),加入caspase-1 siRNA后,能进一步促进VEGFR2蛋白表达(P<0.01)。结论NLXTD可以提高OGD/R损伤后的BMECs增殖、迁移、成管能力,促进血管新生,其机制可能与抑制细胞焦亡caspase-1/Gasdermin D通路,减轻BMECs损伤,上调VEGF、VEGFR2水平有关。

miR-150-5p对脑小血管病大鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响

目的 分析miR-150-5p对脑小血管病(CSVD)大鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响。方法 56只雄性大鼠14只作为正常组并不做处理,剩余42只建立CSVD模型,建模中途死亡6只。将建模成功的大鼠随机分为模型组、上调组、下调组,每组8只,做miR-150-5p转染,鉴定miR-150-5p转染率、氧化应激指标水平、神经凋亡率和乳酸脱氢酶(LDH)释放率。结果 与正常组、模型组相比,上调组miR-150-5p表达量升高,下调组miR-150-5p表达量降低,具有统计学差异(P<0.05),证明miR-150-5p转染成功。与正常组相比,模型组、下调组细胞凋亡率、LDH释放率、丙二醛(MDA)水平升高,超氧化物歧化酶(SOD)水平降低,上调组细胞凋亡率、LDH释放率、MDA水平降低,SOD水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,下调组细胞凋亡率、LDH释放率、MDA水平升高,SOD水平降低,上调组细胞凋亡率、LDH释放率、MDA水平降低,SOD水平升高,具有统计学差异(P<0.05);与上调组相比,下调组细胞凋亡率、LDH释放率、MDA水平升高,SOD水平降低,具有统计学差异(P<0.05)。结论 miR-150-5p可能作用于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,影响CSVD大鼠脑微血管内皮细胞凋亡。

心脑舒通胶囊及有效成分对氧糖剥夺/复氧损伤脑微血管内皮细胞屏障完整性的影响及机制研究

目的探讨心脑舒通胶囊(Xinnao shutong,XNST)及其单体成分对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤脑微血管内皮细胞屏障结构及紧密连接蛋白表达的影响及机制。方法将小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3接种于Transwell小室上层,建立OGD/R损伤模型,通过细胞跨膜电阻值及荧光素-钠透过率考察药物对内皮细胞屏障完整性的影响;采用Claudin-5免疫荧光染色观察内皮细胞间紧密连接结构变化;RT-PCR和Western blot法检测紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平。Western blot法检测MAPKs(JNK、p38、ERK)、I kappa Bα、I kappa B激酶磷酸化蛋白表达水平,Western blot及免疫荧光法检测NF-κB/p65的入核表达。结果XNST及其3个单体成分均能明显增加内皮细胞电阻值,降低荧光素-钠透过率;Claudin-5荧光染色结果显示,模型组细胞间紧密连接明显破坏,而XNST及其单体成分能明显改善其紧密连接结构。RT-PCR及Western blot结果显示其能明显上调Claudin-5、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表达,进一步对其机制研究表明,XNST及其单体成分能明显抑制JNK、p38、ERK的磷酸化,抑制I kappa Bα、I kappa B激酶磷酸化,并明显抑制NF-κB/p65的核转位。结论XNST及单体成分均可通过增加细胞间紧密连接结构促进屏障完整性发挥脑保护作用,其机制可能与抑制NF-κB和MAPKs信号通路激活有关。

lncRNA-H19/IGF1R调控高血压脑出血后脑微血管内皮细胞自噬的机制研究

目的:分析lncRNA-H19(H19)在高血压脑出血(HICH)患者体内的表达特征,并探讨H19影响人脑微血管内皮细胞(HBMECs)自噬与氧糖剥夺(OGD)损伤的机制。方法:收集健康者、高血压患者和HICH患者血液样本,采用lncRNA array芯片检测lncRNA表达谱,RT-qPCR检测H19表达水平并分析其与脑出血量及NIHSS评分的关系;预测H19的靶蛋白,RT-qPCR检测其mRNA水平并分析其与H19的相关关系;采用OGD处理敲降或过表达H19及其互作蛋白的HBMECs,而后采用免疫荧光检测细胞自噬情况,western blotting检测自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)以及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)。结果:H19在高血压患者(t=0.021,P<0.05)和HICH患者(t=0.018,P<0.05)中显著高于健康者;并随HICH分级升高而增加,与脑出血量及NIHSS评分呈正相关关系(R2=0.087,R2=0.113,P<0.05);随OGD处理时间增加,HBMECs中H19水平增加(t=0.023,P<0.05);IGF1R m RNA在HICH患者体内低于健康者(t=0.015,P<0.05),且随HICH加剧而降低(t=0.043,P<0.05);HICH患者体内H19与IGF1R呈负相关关系(R2=0.187,P<0.05);OGD处理下调HBMECs中IGF1R蛋白,敲降H19可使OGD-HBMECs中IGF1R增加;在OGD-HBMECs中LC3自噬体、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α和VEGF均因敲降H19或过表达IGF1R而减少,但同时过表达IGF1R及H19后则均增加。结论:H19与HICH病情相关,下调H19可增加IGF1R,进而缓解OGD诱导的HBMECs自噬和损伤。

肿瘤坏死因子α上调脑血管内皮细胞RH蛋白C表达的机制

目的研究在肝性脑病中发挥强效作用的促炎因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)中RH蛋白C(rhesus glycoprotein of C,RHCG)表达的调控和潜在的作用机制。方法HBMEC复苏,传5代,以适宜浓度铺孔板在孵箱中培养,并通过与TNF-α(浓度为0.1μg/mL内皮细胞培养基ECM)的共培养,按照作用时间不同分组,运用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)及Western Blot,检测HBMEC中RhCG mRNA及蛋白随着TNF-α作用时间延长表达量的变化,并统计变化趋势。根据以上结果选择表达量最高的时间点加PKC抑制剂Safingol处理,分组:(1)TNF-α处理0 h组;(2)TNF-α处理24 h组;(3)Safingol单独处理组;(4)TNF-α+Safingol抑制剂组:预先用Safingol处理HBMEC细胞1 h后,再予TNF-α刺激24 h。应用Western Blot方法检测HBMEC中RhCG蛋白的表达水平,并统计RhCG蛋白不同组别的变化趋势。结果RhCG蛋白随着TNF-α作用时间的延长表达增加,24 h表达量最高。RhCG mRNA随着TNF-α作用时间的延长表达增加,24 h表达量最高。加入处理因素PKC-α特异性抑制剂Safingol后,RhCG蛋白的表达随之下降,差异有统计学意义。结论肿瘤坏死因子TNF-α可以上调HBMEC细胞中RhCG mRNA及蛋白的表达。PKC-α参与TNF-α上调HBMEC中RhCG蛋白表达的调控。

黑斑侧褶蛙脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定

为了建立蛙脑微血管内皮细胞原代培养方法,实验以黑斑侧褶蛙脑组织为实验材料,在无菌条件下分离出大脑灰质,利用0.1%Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶进行消化,经过Percoll密度梯度离心后,将获取的脑微血管段接种于鼠尾胶包被的培养瓶中,于28℃、5%CO_(2)条件下原代培养蛙脑微血管内皮细胞,并通过细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光对细胞进行鉴定,最后用四唑蓝比色法(MTT)测定细胞的生长状态。结果显示,微血管段在体外培养1 d后开始贴壁生长,并逐渐扩大成团簇状,培养至7 d时,细胞呈“铺石路样”镶嵌式排列,表现为区域性单层生长;Ⅷ因子免疫荧光检测发现胞质呈红色,表达为阳性,阳性细胞率达97%以上;MTT实验显示,细胞在第3~5天时生长速率最快。本研究首次建立了蛙脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定方法,为体外研究蛙类神经性疾病的发病机理奠定基础,也为相关药物的研发和筛选提供了细胞模型。

差异过筛法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的:采用差异过筛法培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)。方法:取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、细胞筛网过滤、收集网下滤过物、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO_(2)培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、血管性血友病因子(vWF)免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果:培养24 h后血管段周围爬出短梭形的细胞;48 h后岛屿状的细胞集落形成;72 h后细胞铺满瓶底,呈典型的单层、铺路石样、镶嵌式贴壁生长;免疫细胞化学染色显示,所培养细胞的细胞质呈现棕红色,vWF表达为阳性。结论:差异过筛法能够成功分离培养出原代大鼠BMECs。

树鼩脑微血管内皮永生化细胞系的建立及最适D-半乳糖浓度诱导BMECs衰老细胞模型的探讨

目的建立树鼩永生化脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),明确D-半乳糖对BMECs衰老的影响,探索其潜在机制。方法用携带SV40T基因的慢病毒转染BMECs,传至50代后进行形态观察、生长曲线测定以及免疫荧光和核型鉴定;再用不同浓度D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导BMECs,通过细胞增殖实验确定最适诱导条件,用衰老相关β半乳糖苷酶染色分析细胞衰老情况,Western Blot检测衰老相关蛋白p53的表达水平,超氧化物歧化酶和脂质氧化检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平。结果永生化的细胞生长状态较好,不同代次的细胞形态一致,单个细胞呈短梭形或多角形,整体呈典型的铺路石状;细胞生长曲线显示细胞数量在第2~5天时处于对数生长期,在第6天时达到高峰,之后缓慢增长进入平台期;免疫荧光显示该细胞特异蛋白vWF和CD31及永生化基因SV40T为阳性;细胞核型结果显示永生化细胞染色体数目与滇西亚种树鼩的染色体数量相符;D-gal诱导BMECs抑制细胞增殖,有时间和浓度依赖性;实验组,即浓度为10 g/L的D-gal诱导48 h的BMECs,β-半乳糖苷酶染色阳性明显增多、衰老相关蛋白p53显著增多、细胞内SOD酶活性降低和MDA含量增多。结论成功构建树鼩永生化脑微血管内皮细胞系,10 g/L的D-gal是建立永生化BMECs衰老模型的适合浓度,D-gal在体外促进细胞衰老可能是通过促进氧化应激水平、抑制细胞增殖来实现的。

脑肾素-血管紧张素系统通过脑微血管内皮细胞调控神经血管单元介导阿尔茨海默病机制研究进展

脑血管功能异常是阿尔茨海默病(AD)重要的病理特征之一,而脑肾素-血管紧张素系统(BRAS)病理改变则是AD患者脑血管损伤的重要指标。BRAS相对独立于外周肾素-血管紧张素系统(RAS),并可通过调节神经元和胶质细胞影响神经血管单元(NVU)稳态。脑微血管内皮细胞是NVU的重要成员,由其构成的血脑屏障可能是实现外周RAS与BRAS调控的重要桥梁。本文围绕AD分别介绍BRAS对神经元功能、血管内皮细胞发育及星形胶质细胞和小胶质细胞稳态的影响,从细胞的能量代谢、氧化应激和炎症反应等角度综述BRAS在NVU调节互作网络及在AD病理中的作用。综述RAS药物的临床研究和RAS在AD中的研究进展,以期阐明BRAS对NVU的调控机制及其对AD病理的贡献,为AD的预防和治疗提供新思路。

黄芪甲苷配伍三七总皂苷对OGD/R大鼠脑微血管内皮细胞屏障功能的影响

目的观察黄芪甲苷(astragalosideⅣ,ASTⅣ)配伍三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对氧糖剥夺后再复糖复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,r BMECs)屏障功能的影响。方法原代培养并鉴定r BEMCs,取第3代rBMECs,采用ASTⅣ与PNS高(100μmol/L+60μmol/L)、中(50μmol/L+30μmol/L)、低(25μmol/L+15μmol/L)剂量配伍预处理24 h,以OGD/R建立缺血再灌注损伤模型,同时设立对照组和模型组。CCK-8检测细胞存活情况,利用跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)检测细胞屏障功能的改变,免疫荧光检测血脑屏障连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白含量,Western blot检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达及NF-κB-p65的活化表达情况,ELISA检测细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平。结果成功培养分离rBMECs,阳性表达vWF。与对照组比较,模型组细胞存活数量明显减少(P<0.01),与模型组比较,ASTⅣ与PNS不同剂量配伍均能提高rBMECs的存活率(P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,模型组TEER值、Occludin和ZO-1荧光强度显著降低(P<0.01),与模型组比较,ASTⅣ与PNS不同剂量配伍均能显著增高TEER值(P<0.01)、增加Occludin和ZO-1荧光强度(P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,模型组TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、p-NF-κB-p65表达显著增强(P<0.01),与模型组比较,ASTⅣ与PNS中高剂量配伍组TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、p-NF-κB-p65表达量下降(P<0.01)。结论ASTⅣ配伍PNS能够显著抑制NF-κB活化,降低细胞炎症因子的表达,增高OGD/R模型rBMECs屏障功能,保护缺血缺氧后的脑组织。

CXCL1通过促进蛋白激酶B磷酸化导致bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞骨架收缩和通透性增加

目的探讨脓毒症脑病炎症中CXC趋化因子配体1(CXCL1)及其受体CXC趋化因子受体2(CXCR2)对脑内皮细胞骨架重排和通透性的影响及其相关机制。方法野生型小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立脓毒症脑病模型,ELISA检测全脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CXCL1含量。使用500 ng/mL LPS和200 ng/mL TNF-α刺激bEND.3脑微血管内皮细胞后,Western blot法检测细胞CXCR2的表达。以150 ng/mL CXCL1刺激bEND.3细胞,免疫荧光染色观察脑内皮细胞骨架纤维型肌动蛋白(F-actin)重排的变化。脑内皮细胞通透性实验中,将bEND.3细胞随机分为PBS对照组、CXCL1组、CXCL1联合选择性CXCR2拮抗剂SB225002组,Transwell^(TM)小室检测各组通透性变化情况。CXCL1刺激bEND.3细胞后,Western blot法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达。结果腹腔注射LPS导致小鼠全脑组织中TNF-α和CXCL1水平显著升高;LPS和TNF-α刺激可增高bEND.3细胞CXCR2蛋白的表达。CXCL1刺激bEND.3细胞使其细胞骨架收缩,细胞间隙形成增加,且细胞渗透性增加,而CXCR2拮抗剂SB225002预处理可显著抑制CXCL1引起的脑内皮细胞肌动蛋白应力纤维和细胞间隙的形成、以及通透性的增高,同时CXCL1(150 ng/mL)刺激使得脑内皮细胞AKT的磷酸化水平明显升高。结论CXCL1通过AKT磷酸化激活引起脑内皮细胞骨架收缩、细胞通透性增加,CXCR2拮抗剂SB225002可有效抑制CXCL1诱导的细胞骨架收缩和通透性升高。

单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的 采用单筛过滤法获取脑微血管以培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞。方法 取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、单层细胞筛网过滤、收集网上截留组织、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO_(2)培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养24 h后,短梭形细胞从脑微血管段周围爬出;48 h后“岛屿状”的细胞团簇形成;96 h后细胞融合,呈典型的单层、“铺路石样”、镶嵌式贴壁生长。第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测显示细胞胞质呈现棕红色,表达为阳性。结论 单筛过滤法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。

薄层液面培养法提取大鼠原代脑微血管内皮细胞及对其的鉴定

目的:采用薄层液面培养法提取大鼠原代脑微血管内皮细胞(BMECs)。方法:取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、过筛、Ⅱ型胶原酶消化后获得脑微血管段,并严格精准控制培养液的用量,将其接种于培养皿中进行原代培养。通过倒置相差显微镜对目的细胞的形态学观察、免疫细胞化学染色法对细胞第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRag)的检测进行鉴定。结果:镜下观察到所培养的目的细胞呈典型的单层、铺路石样、镶嵌式排列生长;FⅧRag阳性细胞率达99%以上。结论:薄层液面培养法能够成功分离培养出活性强、纯度高的大鼠原代BMECs。